病毒载体遗传毒性评价方法研究进展

随着基因治疗产品逐渐进入市场,迫切需要建立病毒载体介导的遗传毒性评价方法。目前应用广泛的病毒载体主要有2种:慢病毒载体和腺相关病毒载体。慢病毒载体能够稳定整合到宿主基因组中;而腺相关病毒载体基因组在宿主细胞核中主要以附加体形式存在,仍能以低频率随机整合到宿主细胞基因组中,其整合方式包括随机整合和靶向整合。本文对已有的病毒载体介导的遗传毒性评价方法,包括脱靶修饰的全基因组分析、整合位点分析、核型分析和评估细胞转化潜力试验等进行综述,并对建立准确快速的病毒载体介导的遗传毒性的评价体系予以展望,以期为进一步完善和研发新的病毒载体遗传毒性评价方法提供参考。

纳米银的绿色生物合成及其抗菌实验研究

目的利用蒲公英叶提取液合成纳米银,为纳米材料生物合成领域的研究提供依据。方法利用UV-2450紫外分光光度计、Zetasizer Nano-ZS型激光粒度仪考察了蒲公英提取液、硝酸银浓度、温度、反应时间、pH等条件对纳米银的粒径、分散系数PDI及紫外光谱的最大吸收波长的影响,并通过透射电子显微镜(TEM)、红外光谱仪(FTIR)及zeta电位的测定,对纳米银的特性进行了表征。进一步考察了所制备纳米银对革兰氏菌的抑菌活性。结果得到球形的纳米银,粒度范围为30~60nm;紫外光谱的最大吸收波长为(432±20)nm;zeta电位在(-25.0±10)mV,所得纳米银粒子对革兰氏阳性菌具有更好的抑菌效果。结论利用蒲公英提取液可实现对纳米银的可控合成。

雷公藤甲素生殖毒性及其防治策略研究进展

雷公藤甲素是传统中药雷公藤中最主要的生物活性成分,具有抗癌、抗炎和免疫抑制等功效,临床上用于治疗肿瘤,类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫疾病。然而,雷公藤甲素具有严重的生殖毒性,会造成精子数量减少和活力下降,直接损伤睾丸、卵巢和子宫等,其毒性机制主要与氧化应激、线粒体损伤,及乳腺癌耐药蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体和半胱氨酸蛋白酶3等蛋白表达异常及支持细胞、间质细胞、生精上皮细胞、线粒体和溶酶体等中的标志酶活力下降相关。可通过雷公藤甲素毒性缓解药物、化学结构修饰和新型递药系统等方式缓解雷公藤甲素的生殖毒性。本文主要对雷公藤甲素的生殖毒性、毒性机制及缓解措施的最新研究进展进行综述,为其临床合理应用提供依据。

3D肝细胞遗传毒性检测方法的建立

目的采用人源化肝细胞HepG2细胞与3D细胞培养技术在体外建立3D肝细胞模型,用不同的模式化合物分别建立3D肝细胞微核组学试验方法(cytokinesis-block micronucleus cytome,CBMN-cyt)及3D肝细胞彗星试验方法。方法采用无支架培养方式,选取球体外观、球体内部细胞存活率、Ⅰ和Ⅱ相代谢酶基因表达及肝脏特异性生物标志物表达作为检测指标评估球体生长特性,确定3D肝细胞球体最佳培养条件,并探索3D肝细胞模型用于体外微核组学试验和体外彗星试验的适用性。结果3D肝细胞模型的最佳培养条件为5×10^(3)个细胞/20μL/滴接种,培养7 d。采用体内外微核阳性化合物丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)初步建立了3D肝细胞微核组学方法,可成功检测出MMC的遗传毒性和细胞毒性;与2D肝细胞模型结果对比,3D肝细胞模型在检测微核和核芽时具有更高的灵敏度。采用已知体内外彗星试验阳性化合物甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)建立了3D肝细胞彗星试验方法,MMS在低细胞毒性下可使3D肝细胞的尾DNA%显著性增加,且3D肝细胞模型对MMS遗传毒性检测灵敏度高于2D细胞。结论建立的3D肝细胞模型操作简单,成本低廉,并在体外微核试验和彗星试验中表现出较好的灵敏度和特异性,提示3D肝细胞遗传毒性试验方法在早期药物的遗传毒性筛选和追加试验研究中具有良好的应用前景。

基于细胞外囊泡疗法的非临床评价策略

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)这一概念在2011年由国际细胞外囊泡协会(International Society for Extracellular Vesicles,ISEV)提出,其可作为治疗药物以及药物的递送载体广泛应用于疾病治疗的各个领域。基于EV的疗法可能成为一种除传统药物治疗和细胞治疗之外的疾病治疗新模式——EV无细胞疗法。作为载体,相比于病毒载体和合成非病毒载体,EV具有独特的优势,潜力巨大。但EV由于其特有的生物学性质,在临床转化中具有一定困难。且该领域相对较新,尚无专门针对基于EV疗法的相关政策和法规出台。本文通过ClinicalTrials.gov平台采集信息,总结基于EV疗法的研究进展,针对现有的监管体系提出建议,并对EV非临床研究的一般原则、药学研究、药效学和药代动力学研究及安全性评价等非临床评价策略进行探讨,为制定基于EV疗法的非临床评价研究方案提供参考。

细胞外囊泡活体成像技术的研究进展

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一种由细胞自然分泌的囊泡,包括人体肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞在生理和病理条件下均可分泌。近年来,EVs因其固有的生物相容性、高稳定性、低免疫原性以及在病理过程中的细胞间通信中发挥的重要作用而引起了广泛关注,被认为是有潜力的药物递送载体,还可能具有治疗恶性肿瘤和其他疾病的潜在价值。实现对体内EVs的准确检测是开发EVs疗法的首要关键步骤,目前已开发出不同的标记、成像方法,如光学成像及放射性同位素成像等,使无创体内示踪成为可能,可直接原位研究其生物分布、迁移和靶向特性。该综述简单介绍了EVs的生物学功能,主要论述了可用于EVs体内示踪的不同成像技术,以期促进EVs的体内生物学过程研究,推进基于EVs的纳米医学应用。

临床前肿瘤模型的建立和应用进展

癌症一直是威胁人类生命安全的重大疾病之一,传统的治疗方式无法保证药物针对肿瘤细胞的高效杀伤和治疗后的良好预后,主要原因是人们对肿瘤及其微环境的了解还不够充分。近年来随着人们对肿瘤研究的不断深入,肿瘤的发生机制和肿瘤对人体免疫系统的影响成为当下研究的热点,研究肿瘤细胞的相关机制需要既能够代表人体免疫系统,又能还原患者肿瘤微环境的临床前肿瘤模型。近年来随着各种临床前肿瘤模型的发展,包括以患者肿瘤组织来源的异种移植模型(PDX)为代表的体内模型和以类器官芯片为代表的体外模型,在肿瘤的临床前研究中充当不同的角色并且发挥了各自重要的作用。临床前肿瘤模型作为一种便捷有效的工具,在探索肿瘤与免疫系统相互作用、临床前抗肿瘤药物的评价、发现免疫治疗的生物标志物等方面发挥着不可替代的作用。

^(125)I标记外泌体在Pan02胰腺癌荷瘤小鼠体内的生物分布研究

目的旨在开发用^(125)I-NaI标记外泌体的方法,并通过γ计数仪考察其在Pan02胰腺癌荷瘤小鼠体内的生物分布特征。方法通过非放射性NaI对用于治疗胰腺癌的工程化外泌体进行冷标记,采用透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和Western blotting实验对标记前后外泌体进行表征。在此基础上采用Iodogen法进行外泌体的放射性^(125)I-NaI标记,分离纯化后测定^(125)I-NaI的标记率,Radio-HPLC法测定给药前后^(125)I-外泌体的放化纯度以考察其稳定性;将^(125)I-外泌体单次尾iv于Pan02胰腺癌荷瘤小鼠体内,分别于给药后2、6、24、72 h(每个时间点雌雄各3只)经CO_(2)麻醉后心脏放血处死小鼠,取血清、主要组织器官及肿瘤,γ计数仪测量其放射性计数,计算各组织/血清在不同时间点的蛋白沉淀率;并计算在不同时间点的每克组织(或每毫升血清)放射性计数占总注入放射性计数的百分比(%ID·g^(−1)或%ID·mL^(−1))。结果外泌体表征的结果显示,标记前后的外泌体形态一致,均成圆形或茶托样结构;标记前外泌体粒径峰值为113 nm,标记后外泌体粒径峰值为122 nm,粒径大小主要分布在50~200 nm;均表达其标志性蛋白CD63及TSG101,符合外泌体特征。^(125)I-NaI标记外泌体的标记率为27.82%,纯化后HPLC法测得即时放化纯度为100%,给药后放化纯度为(93.34±5.48)%。在小鼠尾iv给药后2 h,标记的外泌体主要分布在肝脏[(10.8992±1.5181)%ID·g^(−1)]和脾脏[(2.5664±0.7998)%ID·g^(−1)],肿瘤中为[(0.2910±0.0560)%ID·g^(−1)],脑、心脏、脂肪和肌肉组织摄取较少;给药后72 h,肝脏中仍有较高摄取,肿瘤中仍有放射性分布。给药后2~6 h各组织脏器的蛋白沉淀率较低,表明^(125)I-NaI标记外泌体稳定性有所降低。结论外泌体可以进行^(125)I标记,而且标记同位素前后对外泌体物理形态、生物学活性无明显影响;^(125)I标记外泌体的方法简便,标记率和放化纯度均较高;该外泌体产品在荷瘤小鼠体内大部分血流丰富的组织器官均有分布,且具有一定的肿瘤靶向定位能力。

基因治疗递送载体应用现状及安全性研究进展

通过载体将基因药物高效递送至靶组织或靶细胞是基因治疗的关键步骤。选择合适、安全、有效的递送系统是基因疗法中亟待解决的任务。目前采用的基因药物递送载体可分为病毒载体和非病毒载体。该综述介绍了基因治疗中常见的病毒载体、合成非病毒载体和生物非病毒载体的应用现状和相关安全性问题,比较了不同载体的优缺点,并总结了基因递送载体非临床安全性评价考虑要点,以期为基因治疗领域的载体的选择、使用及安全性评价提供参考。

放射性核素偶联药物的研究进展

放射性药物作为一种安全有效的治疗方法正在被越来越多的用于不同类型肿瘤的治疗研究中,通常使用优先与癌细胞结合或通过生理机制积累的药物到达全身或局部病灶,之后通过发射射线对病灶进行辐照以达到杀死癌细胞的效果,此外这些核素能发射可成像的光子,从而可以无创地观察治疗药物的生物分布。放射性核素偶联药物(radionuclide drug conjugates,RDC)结合了精准靶向和强效杀伤两方面的优势,用携带放射性核素有效载荷的特异性单克隆抗体靶向癌细胞,将能量集中释放在细胞直径几倍的范围内,杀死癌细胞的同时最大程度地限制对肿瘤细胞附近正常组织细胞的损害,疗效良好、不良反应小、能够延长患者生存期,对于晚期肿瘤治疗至关重要。

雄性生殖毒性的体外试验方法研究进展

近年来,体外替代试验在雄性生殖毒理研究中愈来愈重要,而构建稳定可靠的体外模型是其有力保障。随着生物技术的发展,体外睾丸模型已从单层的细胞培养过渡到更能模拟体内微环境的新培养体系,如微流控培养、三维(three-dimensional, 3D)培养、类器官培养等。这些培养体系不仅能模拟体内血睾屏障(blood-testis-barrier, BTB)和睾丸微环境,还能通过睾丸组织或生殖细胞培养,延长培养体系持续的时间,更为重要的是啮齿类动物、非人灵长类甚至人类生殖细胞在这些培养体系中都已成功分化出精子,这些新的培养体系也成功应用于睾丸毒物评价。然而,这些新的培养体系仍存一些局限性,如精子分化数量少、效率低以及无法完全复制体内生精进程等。本文主要综述新的睾丸体外培养体系的优缺点以及未来发展方向。

非整倍体诱导剂的检测方法及风险评估

非整倍体(aneuploidy)指细胞核内染色体数不是染色体组的整倍数,包括单体、三体、四体、双三体、缺体等,与恶性肿瘤发生密切相关。非整倍体诱导剂(aneugen)指诱导子细胞染色体数目增加或减少,即导致非整倍体形成的物质。现行的遗传毒性试验指导原则要求评估化学物质诱发非整倍体的可能性,但标准的遗传毒性试验组合不包括专门评估非整倍体诱导剂的试验。微核试验结合FISH和CREST染色为染色体数目畸变提供了直接的证据;体外多终点试验和毒性追踪分析可通过MoA检测非整倍体诱导剂。目前对生殖细胞非整倍体诱导剂进行全面风险评估的数据较少,因此在未来有必要开展非整倍体诱导剂对生殖细胞影响的研究,并对其进行全面的风险评估,以补充这一领域数据的空缺。本文对目前哺乳动物体细胞和生殖细胞中非整倍体形成机制、检测方法、危害以及暴露后的风险评估进行综述。