RNAiFect^(TM)和SuperFect转染试剂对4种细胞活性的影响

在RNA干涉中,转染试剂的用量与siRNAs的量成正相关关系,但因转染试剂对细胞有一定的毒性作用,超过一定用量可以引起细胞形状改变、脱落、甚至死亡,直接影响着干涉的效率,所以确定转染试剂的优化用量,是RNA干涉试验中的重要环节.将不同用量的RNA iFectTM和SuperFect两种转染试剂分别加入鸡胚成纤维(CEF)细胞、293细胞、PK细胞和MDCK细胞中,在4h和24h后观察细胞的活力情况,比较了不同转染试剂对不同细胞的影响.结果表明:相同用量的两种转染试剂对293细胞、PK细胞和MDCK细胞的生长的影响远远小于对CEF细胞的影响;两种转染试剂用于外源小分子转染时,建议在293细胞、PK细胞和MDCK细胞上的用量不超过3u l;两种转染试剂对CEF细胞的毒性较大,不适合用于转染.

短发夹结构RNA干扰新城疫病毒的增殖

以新城疫病毒(NDV)NP基因为标靶,构建3个细胞内表达发夹样结构小干扰RNA(shRNA)的质粒载体,在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚上进行了RNAi试验,筛选出一个有效抑制病毒复制的小分子ndv1.用阳离子脂质体转染试剂Silent-fect将ndv1转染CEF,以不相关shRNA质粒载体HK为阴性对照,4h后接种NDV,与对照相比,干涉组在病毒感染后3hNP基因的表达量降低2.3倍,6h降低21.1倍,9h降低9.8倍;ndv1能在48h内完全阻断NDV在CEF中的增殖,延缓病变出现时间,减轻病变程度.将Silent-fect-ndv1混合物与NDV同时注入10日龄SPF鸡胚绒毛尿囊腔,能使105ELD50NDV感染后17h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少94.4%,使106ELD50 NDV感染后17h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少62.5%.实验结果证实,在CEF中存在RNAi机制,抑制ND VNP基因的表达能有效阻断该病毒增殖,说明NP基因在NDV复制过程中起重要作用.实验结果为进一步利用RNAi技术在CEF和鸡胚中研究病毒基因组功能及筛选抗病毒小分子奠定了基础.

腺病毒载体介导的GFP在鸡胚成纤维细胞中的表达及RNA干涉

鸡胚成纤维细胞(CEF)是多种动物及人类病毒的易感细胞;也是研究鸡的基因组功能的理想材料.本试验的目的是研究非复制型腺病毒载体对CEF的转染效率及安全性;并建立在CEF细胞中进行RNAi的技术平台.采用GFP重组非复制型腺病毒载体(Ade-GFP)转染CEF细胞;结果证明0.1-2000 MOI Adv-GFP均可转染CEF细胞并表达GFP;转染后16h开始出现GFP阳性细胞;胞核与胞浆可见明亮的荧光;荧光细胞数量及荧光强度在24～36h达到高峰;以后逐渐衰减;约180h全部消失;转染效率最高为22.3%;形态学观察及流式细胞仪测定结果显示;Adv-GFP转染的CEF细胞未见细胞病变;多数转染组细胞活力不受影响;说明用Adv-GFP携带外源转染CEF细胞是安全可行的;用脂质体转染试剂转染化学合成的GFP-siRNA;成功地干涉了腺病毒载体介导的GFP基因在鸡胚成纤维细胞的表达;干涉效率为85%;证明了鸡胚成纤维细胞中存在RNAi机制;为进一步利用非复制型腺病毒载体递送siRNA在CEF细胞内进行RNAi的研究奠定了基础.

siRNA干涉禽流感病毒PA基因在鸡胚成纤维细胞中的表达

用阳离子脂体质转染试剂将人工合成的小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)转染鸡胚成纤维细胞(CEF).结果表明,针对禽流感病毒(AIV)H5N1亚型核蛋白(NP)基因的siRNA能在AIV感染后1,2,3 h显著抑制NP基因的表达,表达水平分别降低3,1.4和2.5倍.

荧光定量PCR技术及其在动物病毒病定量检测中的应用

荧光定量PCR技术是一种核酸定量技术,该技术在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.该技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点,因此在动物病毒病的检测中,荧光定量PCR技术不但能定量检测病原体感染的强弱和在机体内的分布,还具有灵敏、快速、省力的特点.

绵羊肺脏中溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及其药物敏感性分析

为了对引起绵羊肺炎的病原进行分离、鉴定和耐药性分析,本研究通过无菌采集绵羊肺脏并对细菌进行分离纯化、生化试验和PCR鉴定,然后对所得到的溶血性曼氏杆菌分离株进行药物敏感性研究。结果显示,分离纯化得到的细菌为革兰氏阴性短杆菌,具有弱溶血性,经生化试验和PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌;耐药性分析显示该菌株对恩诺沙星、庆大霉素、四环素等大部分药物敏感。本研究为绵羊溶血性曼氏杆菌感染的有效防制提供有用的信息和数据。

绵羊肺炎支原体和溶血性曼氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测绵羊肺炎支原体(MO)和溶血性曼氏杆菌(Mh)的方法,本研究根据MO的hsp70基因和Mh的gcp基因分别设计引物,建立了同时检测这两种病原的双重PCR检测方法。实验结果显示该方法能够特异性的扩增MO(135 bp)和Mh(227 bp)DNA片段,其最低检出量分别为2.06×103拷贝/μL和6.37 cfu/mL,与单一PCR相同。该方法对常见的致病菌无交叉反应。对临床样本的检测结果显示MO和Mh的检出率分别为56.25%和52.50%,与单独PCR符合率为100%。研究结果表明,本研究所建立的双重PCR检测方法具有特异性强、敏感性高等特点,为临床上MO和Mh混合感染的快速检测、鉴定以及流行病学调查提供了方便、快捷、准确的方法。

绵羊肺炎支原体p128基因序列分析及原核表达

为进一步探究绵羊肺炎支原体P128蛋白的相关功能,在进行生物信息学分析的基础上,对编码p128的部分基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,并采用Western-blot方法对其免疫原性进行了分析。结果显示,p128基因与猪肺炎支原体黏附素基因p146高度同源;克隆基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在;经纯化的重组蛋白与抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生结合反应,表明P128蛋白是良好的免疫原。研究结果为进一步分析其功能及绵羊肺炎支原体血清学诊断技术的建立提供了有用的信息。

应用PCR快速诊断黄鳝嗜水气单胞菌败血症

根据致病性嗜水气单胞菌的标志性毒力基因-气溶素(aerolysin)基因序列,设计出一对特异性引物,采用PCR方法,对22尾临床疑似患嗜水气单胞菌败血症的黄鳝进行了诊断,检测出其中17尾呈致病性嗜水气单胞菌阳性,检测过程仅需6h;而常规细菌分离鉴定则耗时72h,检出率仅为9/22。

短发夹结构RNA干扰新城疫病毒的增殖

以新城疫病毒（NDV）NP基因为标靶，构建3个细胞内表达发夹样结构小干扰RNA（shRNA）的质粒载体，在鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡胚上进行了RNAi试验，筛选出一个有效抑制病毒复制的小分子ndv1。用阳离子脂质体转染试剂Silent-fect将ndvl转染CEF，以不相关shRNA质粒载体HK为阴性对照，4h后接种NDV，与对照相比，干涉组在病毒感染后3hNP基因的表达量降低2．3倍，

番鸭TLR5基因的序列分析及其在组织中表达分布的检测

为了解番鸭TLR5的全基因序列和它在不同组织器官中的表达分布,采用PCR方法对番鸭TLR5全长O RF区进行扩增,并建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,用该方法对番鸭TLR5 mRNA在组织器官中的分布进行了测定。结果显示,番鸭TLR5基因编码区序列全长2 580 bp,由跨膜区、11个富亮氨酸重复序列(LRR)、1个富亮氨酸重复C端结构域(LRR-CT)以及1个TIR区组成;番鸭与同属的翘鼻麻鸭、绿头鸭比对,TLR5基因序列的同源性分别为98.9%、99.9%,TLR5氨基酸序列的同源性分别为97.7%、99.7%。番鸭TLR5 mRNA在脾、肝、肺中表达量最高,肾、脑、直肠、空肠、十二指肠次之,心、回肠、盲肠最低。