忽地笑α-葡萄糖苷酶2编码基因的分子克隆与原核表达

[目的]克隆忽地笑[Lycoris aurea (L’Hér.) Herb.]α-葡萄糖苷酶2编码基因。[方法]基于忽地笑的转录组数据库,分析功能注释为α-葡萄糖苷酶2的基因片段,通过设计特异性定量PCR扩增引物分析其在各组织中的表达丰度,利用RACE (rapid-amplification of c DNA ends)技术从高丰度组织中克隆获得忽地笑α-葡萄糖苷酶2编码基因。[结果]忽地笑α-葡萄糖苷酶2编码基因Lau Agl2 c DNA全长3 185 bp,开放阅读框为2 961 bp,编码含有986个氨基酸残基的Lau Agl2蛋白质。Lau Agl2蛋白质氨基酸序列具有α-葡萄糖苷酶Ⅱ特征性的保守结构域和天冬氨酸残基组成的活性中心,还具有一些蛋白质糖基化的潜在位点(N-X-S/T共有序列)。Lau Agl2蛋白质与油棕、陆地棉等其他植物的α-葡萄糖苷酶2的氨基酸序列一致性为73.0%以上。利用p ET表达系统,可以在大肠杆菌中实现Lau Agl2蛋白质的诱导表达。[结论]成功从忽地笑花葶和花瓣中克隆到α-葡萄糖苷酶2编码基因Lau Agl2并在大肠杆菌中对Lau Agl2进行了异源表达,为Lau Agl2蛋白质的功能鉴定及其在忽地笑种子萌发与生长发育中的作用研究奠定了基础。

大肠杆菌碳分解代谢抑制及混合C源共利用的研究进展

总结了大肠杆菌中C源分解代谢(carbon catabolite repression,CCR)现象的原理及特点,综述并分析了如何通过对宿主菌进行基因工程改造以解除碳代谢抑制,以实现大肠杆菌利用多种C源。

忽地笑α-葡萄糖苷酶编码基因的分子克隆与原核表达

利用RACE技术从忽地笑(Lycoris aurea(L’Hér.)Herb.)花瓣中克隆获得一个α-葡萄糖苷酶编码基因Lau Agl。该基因cDNA全长2 810 bp,开放阅读框为2 613 bp,编码含有870个氨基酸残基的LauAgl蛋白质。LauAgl蛋白质氨基酸序列具有α-葡萄糖苷酶特征性的保守结构域和天冬氨酸残基组成的活性中心,其N端含有一个由21个氨基酸组成的信号肽序列,还具有一些蛋白质糖基化的潜在位点(N-X-S/T共有序列)。LauAgl蛋白质与石刁柏、椰子、油棕等其他植物的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列一致性达到63%以上。利用pET表达系统,通过截掉其N-端信号肽序列,可以实现LauAgl蛋白质在大肠杆菌中的诱导表达。本研究为Lau Agl蛋白质的功能鉴定及其在忽地笑种子萌发与生长发育中的作用研究提供理论基础。

大肠杆菌突变株QQS101发酵生产琥珀酸初步研究

琥珀酸是一种具有重要应用价值的生物基平台化合物。对大肠杆菌focA-pflBldhA突变株QQS101在严格厌氧条件下生长和葡萄糖代谢能力进行了考察,比较分析了葡萄糖与大肠杆菌混合酸发酵产物的单位碳的还原程度,认为非严格厌氧条件有利于QQS101发酵葡萄糖积累琥珀酸,进一步对有氧生长碳源进行了对比试验的结果表明,以木糖支持有氧生长,QQS101摇瓶发酵39h消耗葡萄糖37.6g/L,琥珀酸的产量达到31.01g/L,摩尔产率为1.258molSuccinate/molGlucose。发酵过程中,丙氨酸的添加能够提高琥珀酸的摩尔产率。

植物CPR基因密码子偏好性及聚类分析

细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)在植物的生长、发育、天然产物的合成和抵御外界刺激的过程中发挥重要作用。本研究通过利用12种植物的36个CPR基因,运用Codon W软件分析密码子的偏好性指标,并分别运用SPSS和MEGA5.0软件进行密码子偏好性和基因聚类分析。结果显示,单子叶植物和双子叶植物CPR基因的有效密码子数(effective number of codons,ENC)范围分别为52.92~58.17和46.85~53.58,密码子偏好性较弱。全部CPR基因位点在ENC绘图中均偏离ENC期望曲线,其密码子偏好性主要是受自然选择压力的影响。单子叶植物和双子叶植物CPR基因对同义密码子的偏好性存在差异;同种植物不同CPR基因的密码子偏好性也不同。在基于基因同义密码子相对使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)的聚类中,单子叶植物CPR基因和双子叶植物CPR基因分别聚为一支,更接近于12种植物的传统系统分类,反映了物种的进化关系,可以作为物种系统发育分析的重要补充。在基于基因编码序列(coding sequence,CDS)的系统进化树中,同种植物的CPR基因分别聚到两个支上,一定程度上反映了CPR基因的分类和功能。本研究结果从密码子偏好性和蛋白质水平上说明同种植物的不同CPR基因存在功能与进化差异,为植物CPR基因的分类与演化、功能预测与表达以及植物育种研究奠定了基础。

忽地笑CYP98A的分子克隆与表达分析

利用RACE技术从忽地笑(Lycoris aurea(L’Hér.)Herb.)花葶中克隆获得细胞色素P450酶98A亚家族蛋白编码基因LaCYP98A。该基因cDNA全长1 794 bp,开放阅读框为1 518 bp,编码含有505个氨基酸残基的LaCYP98A蛋白。LaCYP98A具有细胞色素P450酶特征性的亚铁血红素结合结构域和半胱氨酸残基组成的活性中心。LaCYP98A与拟南芥、大豆等其他植物CYP98A氨基酸序列的一致性在60%以上,且具有CYP450的所有特征模序。LaCYP98A定位于植物细胞的内质网,其N-端29个氨基酸对于其亚细胞定位具有重要的作用。利用pET表达系统,通过截掉其N-端内质网定位区域,可以实现LaCYP98A在大肠杆菌中的诱导表达。本研究为LaCYP98A的功能鉴定和植物细胞色素P450的原核表达及其催化的次级代谢产物的异源合成奠定了基础。