大鼠原代脂肪细胞中单个GLUT4囊泡的成像——全内反射荧光显微成像技术的应用

本研究采用高斯拟合算法与全内反射荧光显微技术(TIRFM),通过实时动态的单粒子追踪拍摄来分析原代培养大鼠脂肪细胞基础条件及胰岛素刺激下细胞膜附近绿色荧光蛋白(GFP)标记的GLUT4囊泡的运动变化.使用高斯拟合来消除光学成像系统中发生的原始样品中单像素点荧光强度值的污染,重建出囊泡真实的中心点荧光强度值.通过对序列图像中的囊泡点应用高斯拟合和相应的搜索算法,得到所有囊泡的高斯中心点荧光强度值序列,继而描绘出囊泡的动态转运路径.结果表明,基础条件下膜附近的多数GLUT4囊泡处于沿同一路径的快速长距离转运状态;胰岛素刺激后,长距离转运的GLUT4囊泡数量减少,多数GLUT4囊泡固定成团或者在原地摆动呈限制性的运动.当GLUT4囊泡锚定至膜上后,即迅速与膜融合.说明高斯拟合算法及全内反射荧光显微技术的结合可以很好地实现囊泡纳米尺度的三维实时追踪.

TIRF显微镜下GLUT4囊泡的三维运动分析

利用TIRF显微镜动态实时地观测了GLUT4囊泡在脂肪细胞内的运动,并针对TIRF显微镜消散场成像的特点,提出了一种新的三维单粒子跟踪算法。算法首先针对囊泡的荧光淬灭问题,对荧光强度作了校正;然后,应用自适应的背景减除算法,分割出了运动的囊泡;最后,在跟踪过程中引入了Kalman滤波,减小了搜索的范围,从而避免了背景噪声以及虚假目标的干扰。对囊泡在胞内的长距离运动作跟踪实验,结果表明算法不但在成像平面上取得了很好的跟踪效果,而且也有效地推算了囊泡在垂直于成像平面方向上的运动。