谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体的构建及强信号肽筛选

强信号肽的使用是提高蛋白分泌效率的关键,筛选强信号肽具有重要的应用价值。本试验以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌基础穿梭载体pAU2为骨架,以枯草芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶AprE为报告蛋白,分别使用强启动子tac-M和谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点一致序列来控制报告基因的转录和翻译,成功构建谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体pAU20。分别对来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、以及谷氨酸棒杆菌中共16种Sec型信号肽编码序列进行PCR扩增,与pAU20连接,转化谷氨酸棒状杆菌,获得重组信号肽探测载体工程菌株。工程菌株摇瓶发酵培养物上清液AprE酶活测定结果表明,C. glutamicum/pAU20-Vpr、C. glutamicum/pAU20-BprA上清液比酶活分别为180.02和167.6U/mg蛋白质,均显著高于C.glutamicum/pAU20-cgr2070上清液比酶活(105.09 U/mg蛋白质);C. glutamicum/pAU20-oppA、C. glutamicum/pAU20-Epr、C. glutamicum/pAU20-cgr2063和C.glutamicum/pAU20-ywaD上清液比酶活分别为96.68、86.18、82.52和80.56U/mg蛋白质,均稍低于C. glutamicum/pAU20-cgr2070上清液比酶活。这些结果表明,信号肽Vpr、BprA、cgr2070、oppA、Epr、cgr2063和ywaD都属于谷氨酸棒杆菌强信号肽。

谷氨酸棒杆菌Cgl0864基因强启动子的鉴定

鉴定强启动子可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)代谢工程育种及重组蛋白生产提供高效的基因表达调控元件,但谷氨酸棒杆菌内源性强启动子的鉴定鲜有报道。本试验进行谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株细胞全蛋白二维电泳并对高表达蛋白质斑点进行质谱分析,选取分子量大小约为30 kDa、等电点约为4.6的斑点作为研究对象,分析其所对应蛋白编码基因的启动子。启动子预测结果表明,谷氨酸棒杆菌Cgl0864基因启动子P0864转录活性强。将强启动子Ptac-M和启动子P0864分别插入启动子探测载体pDXW-11,转化ATCC13032菌株感受态细胞,获得工程菌株C. glutamicum/pDXW-11-Ptac-M和C. glutamicum/pDXW-11-P0864。氯霉素耐受性试验结果显示,菌株C.glutamicum/pDXW-11-Ptac-M和C.glutamicum/pDXW-11-P0864的氯霉素耐受性分别为30和40μg/mL;报告蛋白CAT氯霉素酰基转移酶活性检测结果显示,C.glutamicum/pDXW-11-Ptac-M和C.glutamicum/pDXW-11-P0864菌株细胞抽提物上清液CAT蛋白氯霉素酰基转移酶比活力分别为4.50和6.12 U/mg;氯霉素乙酰基转移酶基因cat转录水平的荧光定量PCR试验检测结果显示,cat基因在启动子P0864的控制下,其转录水平是在Ptac-M控制下转录水平的1.84倍。以上结果表明,谷氨酸棒杆菌Cgl0864基因启动子P0864是强启动子。

基于二维电泳高表达蛋白斑点的谷氨酸棒杆菌强启动子P1937的鉴定

为了构建高效谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)细胞工厂,需要开发出更多的高效基因表达元件。强启动子的使用是使基因高效表达的关键环节,然而关于谷氨酸棒杆菌强启动子鉴定的报道十分少见。本试验基于谷氨酸棒杆菌细胞全蛋白二维电泳,对其中分子量大小约为30 KDa、等电点约为4.0的斑点进行研究,分析其对应蛋白编码基因的启动子。根据试验结果表明,Cgl1937基因的启动子P1937具有更高的转录活性。将强启动子Ptac-M和启动子P1937分别连接到启动子探测载体pDXW-11上,通过电转化进谷氨酸棒杆菌C. glutamicum ATCC13032感受态细胞,以获得工程菌株C. glutamicum/pDXW-11-Ptac-M和C. glutamicum/pDXW-11-P1937。测试工程菌株对氯霉素的耐受性,实验结果表明,菌株C. glutamicum/ pDXW-11-Ptac-M和C. glutamicum/pDXW-11-P1937的耐受性分别为30 μg/mL和40 μg/mL;对报告蛋白氯霉素酰基转移酶CAT酶活进行检测,结果表明,C. glutamicum/pDXW-11-Ptac-M和C. glutamicum/ pDXW-11-P1937的酶比活力分别为0.85 U/mg蛋白质和9.53 U/mg蛋白质;通过荧光定量PCR检测两种工程菌株氯霉素乙酰基转移酶cat基因转录水平,实验结果显示,cat基因在启动子P1937的控制下,其转录水平是Ptac-M的2.07倍。以上结果表明,谷氨酸棒杆菌Cgl1937基因的启动子P1937为强启动子。