纳米金对PCR扩增效率影响的机制探讨

近年来,纳米金粒子对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的增效作用倍受关注,但是其具体的机制仍未明确提出。研究发现在PCR反应中,纳米粒子的增效作用是存在最佳浓度的,增加DNA聚合酶或者小牛血清蛋白(BSA)可以消除纳米金粒子导致的抑制。我们认为,纳米金粒子可能起到了类似于聚合酶β亚基的作用,提高了DNA聚合酶的延伸能力;而过量纳米金对PCR的抑制作用可能与纳米金结合单链DNA产生的位阻效应有关。

微流控振荡流反转录聚合酶链式反应快速检测烟草花叶病毒

建立了一种基于毛细管的振荡流反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的微流控装置检测烟草花叶病毒(TMV)的新方法。根据TMV移动蛋白基因设计一对PCR引物,对粗提纯TMV颗粒直接进行RT-PCR。用0.025%小牛血清蛋白(BSA)对反应毛细管内壁进行静力学和动力学钝化,提高了PCR效率。在此微流控装置上进行RT-PCR,流速为70μL/min时,检出限为0.01μg cDNA;可以在17min内成功扩增出179bp的目的DNA片段。

激光技术在聚合酶链式反应微流控芯片中的应用

评述了激光技术在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)微流控芯片领域中的应用进展,包括激光技术在PCR微流控芯片微加工、微流体物理参数测量、温度循环控制以及芯片上在线产物检测(包括荧光实时定量/终点和毛细管电泳检测)中的应用。最后,展望了激光技术在未来基于PCR的微全分析系统(micro-total analysis system,μTAS)中的新应用。

集在线荧光分析的连续流动反转录-聚合酶链式反应快速扩增检测食源致病性轮状病毒

采用含RNA反转录(Reverse transcription,RT)和在线荧光分析的连续流动聚合酶链式反应(Poly-merase chain reaction,PCR)微流控技术检测食源致病性轮状病毒。此RT-PCR微流控装置以加热铜块组成恒温带,以聚四氟乙烯毛细管微通道为反应体系构建而成。采用循环水冷却退火区,此装置能获得低至31℃的退火温度,而且温度控制及其稳定性良好,因而能满足不同PCR的要求。为了充分体现PCR微流控技术的优越性,在线荧光分析被用于检测PCR产物。当流速为7.5 mm/s时,轮状病毒RNA的cDNA扩增和在线荧光分析能在约12 min完成(扩增约10 min,在线分析约2 min)。在此集成化的RT-PCR微流控装置上,1 h可完成轮状病毒RNA的RT-PCR以及其扩增产物的在线荧光分析,样品检出限达到6.4×104 copies/μL。

微流控振荡流PCR快速检测单增李斯特氏菌

一种高通量振荡流PCR微流控技术已被成功开发,借此来快速检测食品致病菌-单增李斯特氏菌(L.monocytogenes)。该PCR微流控装置主要由基于LabView的温度控制与采集系统、三个铜加热块以及聚四氟乙烯(PTFE)毛细管等构成。在该微流控装置上,三个铜块维持PCR反应所需要的三个温度,而包埋在铜块沟槽中的PTFE毛细管作为PCR的反应通道。毛细管通道中的PCR溶液通过精密注射泵驱动实现往复振荡,从而实现基于振荡流PCR的DNA快速扩增。当流速为300μL/min时,135 bp DNA基因片段能在14min内成功扩增,L.monocytogenes检测极限为10 cfu/mL。目前开发的高通量振荡流PCR系统能同时检测水、牛奶、香蕉以及香肠中的L.monocytogenes。

抑炎性细胞因子在多发性硬化中的研究进展

多发性硬化是最常见的中枢神经系统炎性脱髓鞘性疾病,目前其病因及发病机制尚不明确,治疗手段也有限。抑炎性细胞因子通过参与免疫耐受性的产生,降低多发性硬化患者体内的炎性反应。合理地理解抑炎性细胞因子在多发性硬化中的免疫调节机制,将对多发性硬化发病机制及相关药物治疗的研究有重要价值。

体细胞重编程的转化医学研究

脑血管疾病、痴呆、糖尿病、恶性肿瘤、骨退行性病等重大临床疾患的发病率、患病率、病死率和致残率居高不下,细胞保护与细胞损伤修复药物、策略和方法的转化研发、应用与推广一直停滞不前或进展过缓应是其重要原因之一。本研究通过医学、生物学、数据库构建、程序编写、软件研制、统计分析及管理工程等多个领域专业人员的通力合作,对2012年诺贝尔生理学或医学奖两位获奖者关于"成熟细胞可以被重编程而多能化"的原始研究及其被引用的大规模复杂信息数据做整体定量对比和局部关联解析,探讨体细胞重编程研究的临床应用前景和实现策略,发现两位获奖者原创性研究及其影响在时间、学科、科学和技术等多个层面与角度上差异具有统计学意义,揭示和证明了加强与加快转化医学和转化神经科学研究的时代意义、紧迫需求、重要方向、目标与路径及我国医学科研管理体系因此所面临的重要挑战。

绞股蓝对环磷酰胺致免疫力低下小鼠的免疫调节及菌群紊乱调节

目的探讨绞股蓝水提物对环磷酰胺诱导免疫力低下小鼠免疫力及菌群紊乱的影响。方法利用免疫抑制剂环磷酰胺诱导建立免疫低下小鼠模型。将21只SPF小鼠随机分为对照组、模型组和绞股蓝组,每组7只。建模后测定脾脏指数、脾脏淋巴细胞亚群水平,采用高通量测序技术分析各组小鼠结肠内容物菌群。结果绞股蓝水提液能增强免疫功能低下小鼠的免疫功能,显著提高免疫低下小鼠的脾脏指数及CD4^(+)T淋巴细胞水平,从而发挥免疫调节作用。绞股蓝水提液还可以显著降低小鼠肠道菌群中致病菌葡萄球菌的相对丰度,增加乳杆菌、拟杆菌等有益菌的相对丰度,从而发挥其免疫调节能力。结论绞股蓝水提液能够提高环磷酰胺诱导免疫力低下小鼠的免疫力,其机制可能与调节肠道微生态平衡密切相关。

YNS益肤面霜对豚鼠皮肤变态反应及肠道菌群的影响

目的建立豚鼠皮肤变态反应模型,并使用YNS益肤面霜对皮肤变态反应模型进行干预,探讨这种面霜对改善及修复受损皮肤的作用及其对豚鼠肠道菌群的影响。方法豚鼠24只,随机分成4组:对照组、阳性组、化妆品组和治疗组,每组6只。致敏接触后进行激发反应。提取4组豚鼠粪便标本DNA,使用16S rRNA高通量测序检测肠道菌群构成。结果治疗组豚鼠皮肤致敏率为16.7%。益肤面霜治疗对肠道菌群alpha多样性影响不大,但有降低厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)比值(F/B)及粪球菌属(Coprococcus)相对丰度的趋势,有利于皮肤变态反应豚鼠肠道菌群组成的恢复。结论YNS益肤面霜对皮肤具有改善及修复作用,并对豚鼠肠道菌群具有一定影响。

适量饮酒对大鼠肠道菌群与血脂水平的影响及二者相关性

目的 探究适量饮酒对大鼠肠道菌群和血脂水平的影响以及肠道菌群与血脂水平相关性。方法 28只雄性SD大鼠随机分为4组:对照组、乙醇组、低剂量白酒1组及低剂量白酒2组。分别灌胃生理盐水、酒精(1.83 g/kg)、白酒(1.83 g/kg和3.66 g/kg两个剂量),连续灌胃30 d。检测大鼠血清高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)水平,采用16S rDNA测序分析各组肠道菌群差异菌种并分析肠道菌群与血脂水平相关性。结果 实验表明适量饮用白酒组较乙醇组可降低大鼠血清TG和TC水平。16S r DNA测序分析显示适量饮酒组较乙醇组可增加肠道脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、瘤胃球菌属(Ruminococcaceae_UCG-005)、罗氏菌属(Roseburia)、别样棒菌属(Allobaculum)及粪杆菌属(Faecalibaculum)相对丰度。其中Desulfovibrio与TG和TC水平呈负相关,Ruminococcaceae_UCG-005和Allobaculum与TC水平呈负相关,Roseburia与HDL水平呈负相关,Faecalibaculum与HDL、TG和TC水平均呈负相关。结论 适量饮酒可增加肠道菌群中与血脂水平成负相关的有益菌数量,从而对血脂代谢起到一定的改善作用。

连续流动微流控PCR快速检测转基因植物的实验研究

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是现代分子生物学研究中最重要的技术之一,在医药研究领域中日益成为各实验室必不可少的技术。

不同类型益生菌制剂在胃肠道中耐受程度的对比

目的对市场销售的几种不同类型益生菌制剂进行胃、肠液耐受程度比较,评价各益生菌制剂活菌数量,为临床选择益生菌制剂提供参考。方法选择7种菌粉及某颗粒益生菌、国产某晶球、日本产某晶球、某胶囊益生菌、圣邦步步佳肠释益生菌共12种口服益生菌产品,在崩解时限仪中加入人工胃液进行崩解试验,在0.0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h和2.0 h时吸取上述样品并进行浓度梯度稀释,并在MRS固体培养基上培养后进行活菌计数。在上述5个时间点吸取部分益生菌-胃液混合物(针对益生菌粉末)或取出益生菌产品(针对晶球、肠溶胶囊、肠释益生菌)换人工肠液再进行40 min崩解,在MRS固体培养基上培养后进行活菌计数。结果粉末状益生菌制剂对人工胃液的耐受能力普遍较差。某颗粒益生菌、国产某晶球、日本产某晶球、某胶囊益生菌、圣邦步步佳肠释益生菌在人工胃液中不崩解。圣邦步步佳肠释益生菌在人工肠液中40 min完全崩解且活菌数峰值较高。结论圣邦步步佳肠释益生菌对人工胃、肠液耐受能力较强,且活菌数较高。

灵芝子实体-益生菌发酵液对环磷酰胺诱发的肠黏膜损伤及菌群紊乱的调节作用

目的建立灵芝子实体-益生菌发酵体系,并研究该发酵液对于环磷酰胺诱导的肠黏膜损伤及菌群紊乱的防治作用。方法通过吸光度(A值)、多糖含量检测等方法评价嗜酸乳杆菌及短双歧杆菌在灵芝子实体提取液中的生长情况。将混合益生菌菌种与灵芝培养基进行共同发酵,发酵液用于对环磷酰胺诱导的肠黏膜损伤模型小鼠的治疗。结果嗜酸乳杆菌、短双歧杆菌均能在灵芝子实体的培养基上生长,且A值及总糖含量均高于对照组。该发酵液对环磷酰胺诱导的肠黏膜损伤模型动物有一定的治疗作用,表现为发酵液干预后由环磷酰胺导致的小鼠体质量降低、结肠组织损伤、炎细胞浸润均有所缓解;并恢复肠道菌群结构,显著增加乳杆菌属丰度,降低肠球菌属和鞘脂单胞菌属丰度。结论灵芝子实体-益生菌发酵液可以有效改善环磷酰胺诱导的肠黏膜损伤的症状,其机制可能与调节肠道微生态平衡密切相关。

舍得老酒对大鼠肠屏障功能及肠道菌群的影响

目的 探究舍得老酒对大鼠肠屏障功能及其肠道菌群构成的影响。方法 将28只SPF级180~220 g SD雄性大鼠随机分为4组(n=7):对照组、乙醇组、舍得老酒1组及舍得老酒2组。分别灌胃生理盐水、酒精(7.6 mL/kg)及舍得老酒(3.8 mL/kg和7.6 mL/kg 2个剂量),连续灌胃4周。检测结肠紧密连接蛋白mRNA表达水平,血清炎症相关分子水平;采用流式细胞仪检测脾脏免疫细胞水平;采用测序检测粪便肠道菌群构成。结果 乙醇组大鼠紧密连接蛋白mRNA表达水平较低,血清中的肿瘤坏死因子-α浓度较高,白介素10浓度较低,而舍得老酒2个剂量组均不同程度地改善了乙醇对大鼠肠屏障功能的不良反应。舍得老酒7.6 mL/kg剂量组可能通过降低CD4+T细胞比例而减少炎症的发生。舍得老酒3.8 mL/kg组大鼠肠道菌群alpha多样性高于其他3组。4组大鼠肠道菌群组成具有一定差异,门水平上,乙醇组拟杆菌门相对丰度较其他组高,厚壁菌门与拟杆菌门比值(F/B)低于其他3组;属水平上,乙醇组Ruminiclostridium_6、Prevotella_9及Lachnospiraceae_NK4A136_group丰度较对照组增加,舍得老酒3.8 mL/kg组的接近对照组,乙醇组Lactobacillus丰度降低,舍得老酒3.8 mL/kg组Lactobacillus丰度增加。结论 低剂量组舍得老酒可改善大鼠肠屏障功能,并可通过增加肠道菌群丰度及多样性、抑制部分肠道致病菌的生长及增加有益菌,从而起到一定的调节肠道菌群的作用。

益生菌联合药食同源材料改善常用抗结核药所致小鼠肝损伤和肠道菌群紊乱的作用

目的 探讨益生菌与药食同源材料补充对异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺4种抗结核药联用所致小鼠肝损伤及肠道菌群紊乱的影响。方法 将30只SPF级雄性ICR小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组,每组10只,其中模型组和治疗组小鼠给予4种抗结核药建立肝损伤模型,治疗组在此基础上给予益生菌联合药食同源材料组方。持续灌胃2周后每组随机抽取5只小鼠处死取材。剩余小鼠停止抗结核药灌胃,仅继续给予组方灌胃1周。检测血清中生化指标丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、总胆红素(TBiL)、尿酸(UA)及白蛋白(Alb)水平。采用流式细胞术分析各组5只小鼠脾脏免疫细胞亚群比例。提取结肠内容物DNA,采用16S rDNA测序分析各组肠道菌群构成。结果 益生菌联合药食同源材料可显著减轻抗结核药联用导致的小鼠ALT、AST、TC及TBiL水平的增加,同时缓解抗结核药联用导致的小鼠脾脏CD3^(+) T、CD4^(+) T细胞的减少。与模型组相比,治疗组小鼠肠道乳杆菌属和拟杆菌属相对丰度略有增加,葡萄球菌属相对丰度显著降低。第21天治疗组小鼠肠道菌群Alpha多样性与模型组相比显著增加。结论 益生菌联合药食同源材料对抗结核药联用所致的肝损伤及肠道菌群紊乱具有一定改善作用,且随干预时间的延长效果更明显。

类风湿性关节炎患者肠道真菌菌群特征

目的 分析类风湿性关节炎(RA)患者肠道真菌菌群多样性变化。方法 纳入RA患者30例,健康体检者31例。采用ITS2高通量测序法测定RA患者与健康体检者共61例粪便样本的真菌构成。通过Alpha与Beta多样性、t检验及LEfSe分析比较2组间的真菌物种组成及差异。结果 RA患者肠道中假丝酵母菌属(Candida)的丰度有所上升,并富集节担菌属(Wallemia)、黄孢原毛平革菌属(Phanerochaete)、Suhomyces、弯颈霉属(Tolypocladium)、共球藻属(Trebouxia)、银耳属(Tremella)、Scolecostigmina属及帚枝霉属(Sarocladium)。结论 RA患者的肠道真菌菌群多样性没有发生显著改变,但其菌群结构发生改变,这些改变可能与RA的发生相关。

前列腺素E2对肾脏集合管水转运的调控作用

前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)是一种脂质介质,通过与4种G蛋白耦联受体(EPl、EP2、EP3、EP4)作用,参与多种生理和病理生理过程。越来越多的证据表明,PGE2通过多种机制参与肾脏水转运的调节以维持机体水稳态。水稳态主要依赖精氨酸血管加压素(arginine vasopressin,AVP)对水通道蛋白-2(aquaporin-2,AQP2)在肾脏集合管上皮细胞的表达和膜转位的调节来维持。近年来,局部调控因素如PGE2在肾脏集合管水重吸收调节中的作用受到了广泛关注。本文综述了PGE2在肾脏集合管水重吸收调节中的作用,并讨论了其合成通路限速酶和各种EP受体在其中的不同作用机制,为尿崩症、水肿等临床体液紊乱疾病的治疗提供新的策略。

法尼醇X受体(FXR)通过诱导肝脏抗凝血酶Ⅲ的表达抑制小鼠凝血过程

法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)已被发现可在凝血系统中发挥重要作用,包括抑制血小板功能、促进纤维蛋白原表达等。然而至今,FXR在凝血系统中的调节机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨FXR对抗凝血酶Ⅲ (antithrombin Ⅲ,AT Ⅲ)的调节作用。用FXR特异性激动剂GW4064 (每天30 mg/kg)处理野生型(WT)和FXR基因敲除(FXR KO) C57BL/6小鼠1和3天,结果显示,在WT小鼠上,FXR激动可显著延长凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间,降低活化凝血因子X (activated factor X, FXa)活性,降低活化凝血因子Ⅱ (activated factor Ⅱ, FⅡa)和凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,TAT)浓度,升高血浆AT Ⅲ浓度,使血液处于低凝状态;当FXR敲除时,以上指标全部逆转,血液处于高凝状态。激动FXR后,WT小鼠肝脏AT Ⅲ表达增加;而FXR KO小鼠肝脏中AT Ⅲ表达较WT小鼠明显降低。体外研究结果显示,GW4064和FXR过表达腺病毒均可显著上调小鼠原代肝细胞中AT Ⅲ的表达,相反,siRNA敲减FXR可明显抑制AT Ⅲ表达。AT Ⅲ启动子区含有FXR结合位点,GW4064可显著上调Luc-AT Ⅲ荧光素酶活性并增加FXR与AT Ⅲ启动子区的结合。以上结果提示,FXR可通过直接转录调控AT Ⅲ的表达而抑制凝血过程。本研究揭示了FXR在凝血平衡中的新作用,提示FXR可能成为血液高凝状态相关疾病的潜在治疗靶点。

α-1,6葡聚糖与低聚异麦芽糖对益生菌和人体肠道菌群的影响比较研究

目的比较α-1,6葡聚糖和低聚异麦芽糖对益生菌的体外增殖作用,评价2种低聚糖对人体肠道菌群的影响。方法脆弱拟杆菌在分别含有2种低聚糖的不同培养基中发酵,活菌计数绘制生长曲线;采集12位健康志愿者的新鲜粪便,将肠道菌群悬液按10%的接种量分别接种于Control组(含氮基础培养基)、α-1,6葡聚糖组(含氮基础培养基加1%α-1,6葡聚糖)及低聚异麦芽糖组(含氮基础培养基加1%低聚异麦芽糖),37℃恒温静态厌氧发酵24 h。采用高通量测序技术分析粪便发酵液菌群结构;应用高效液相色谱法检测粪便发酵液中短链脂肪酸(SCFAs)水平。结果α-1,6葡聚糖促进脆弱拟杆菌增殖的能力较低聚异麦芽糖强[(5.27±0.33)vs(4.80±0.66),×10^(8)CFU/mL];粪便发酵实验显示α-1,6葡聚糖可降低粪便中厚壁菌门/拟杆菌门比值(t=2.821,P=0.0478),显著提升SCFAs水平(丙酸:t=3.750,P=0.0092;丁酸:t=5.747,P=0.0018)。结论α-1,6葡聚糖可以改善肠道菌群结构并促进SCFAs产生。