一种高活力分离肿瘤浸润淋巴细胞方法的建立

肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）的增殖力、活力、杀伤力是ＴＩＬ临床治疗的基本问题。由于Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ方法存在着许多不足之处。本实验室对其一些重要步骤进行了改进：①用单一冷胶原酶消化肿瘤组织块；②省去影响ＴＩＬ活力的离心操作；③ＴＩＬ培养４８ｈ内除去掺杂在ＴＩＬ中的肿瘤细胞等。由于除去了影响ＴＩＬ活力的抑制因素，ＴＩＬ的增殖率、生存率、活力、杀伤力明显增加。有８０％肿瘤组织的ＴＩＬ经扩增可超过１×１０￣９细胞数，生长周期曲线反映了冷酶法的增殖率超过Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ方法。本方法的建立，为ＴＩＬ克隆、建株打下了基础，显示了ＴＩＬ临床治疗潜能的提高。

DHBV诱发鸭急性肝坏死动物模型的建立

本文首次报道了应用鸭乙型肝炎病毒(DHBV)加大肠杆菌内毒素诱导方法,建立了鸭急性肝坏死动物模型。结果发现:先肝内注射大肠杆菌内毒素,24h后再静脉内激发性注射DHBV者,易造成一叶或二叶肝坏死。而第一次肝内注射内毒素,24h后静脉内注入生理盐水,或二次均注入生理盐水者均未发现肝坏死病理变化。若第一次肝内注入DHBV,第二次静脉内注入内毒素,病理变化则明显轻于第一种方法,仅出现轻微散在斑点状坏死。

酶消化对肿瘤浸润淋巴细胞活力影响的研究

本文系统地研究了酶消化（胶原酶Ⅳ、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶和胰蛋白酶）对肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）活力、增殖力等影响，并用单个酶消化法与Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ法比较。结果提示：胶原酶Ⅳ或胶原酶Ⅱ消化肿瘤组织块时对ＴＩＬ细胞活力、增殖力损伤小；透明质酸与胰蛋白酶消化对ＴＩＬ细胞活力、增殖力损伤大。在３７℃，１ｈ消化组与４℃，２４ｈ消化组对同一来源肿瘤组织酶消化配对比较中，结果提示同一酶４℃。

TNF基因转导肿瘤浸润淋巴细胞的方法学研究

在总结Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ建立的ＴＮＦ－ＮｅｏＲ缺陷型逆转录病毒转染肿瘤浸润细胞（ＴＩＬ）的基础上，选用美国国家卫生院重组ＤＮＡ咨询委员会（ＲＡＣ）批准的逆转录病毒（Ｍｏ－ＭｕＬＶ）的衍生物作载体，对肿瘤坏死因子转导ＴＩＬ进行研究。实验结果提示：ＴＩＬ处于静息期与对数生长后期，当ＴＮＦ－ＮｅｏＲ缺陷型逆转录病毒转导ＴＩＬ细胞时，ＴＩＬ细胞增殖受到影响；最佳转导时间为ＴＩＬ分离培养后９～２５ｄ。各病毒感染复数值病毒转导对ＴＩＬ增殖倍数与生存天数影响不大，但病毒感染复数值越大，转导后ＴＩＬ起始呈抑制现象越大；然而Ｇ_（４１８）筛选后证实，病毒感染复数值越大，转导成功率越大。Ｌ_（９２９）细胞检测转导后ＴＩＬ呈高表达，ＰＣＲ检测ＴＮＦ目的基因已插入宿主ＤＮＡ中。

卵巢癌浸润淋巴细胞的生物学特性研究

目的 :研究卵巢癌浸润淋巴细胞 (TIL)在体外扩增后生物学特性 ,评估TIL用于晚期卵巢癌治疗的前景。方法 :利用流式细胞仪分析TIL的细胞表型 ,使用分子生物学和免疫学方法研究TIL分泌细胞因子的能力和杀伤肿瘤细胞的活性。结果 :TIL细胞表型的差异可能与肿瘤的种类、性质、取材部位有关 ,结缔组织、基质中来源的TIL以CD3+ CD4+ 为主 ,肿瘤组织和小血管周围以CD3+ CD8+ 为主 ,体外IL 2的浓度对TIL的免疫学特性有很大的影响。经rIL 2扩增后 ,TIL分泌产生IL 2、TNF α、IFN γ等多种细胞因子能力及杀伤肿瘤细胞的活性均有明显提高。再加入抗CD3单抗或PHA(合适浓度 ) ,TIL细胞因子表达可进一步增强。TIL联合磷酰胺或IL 2治疗晚期卵巢癌患者 ,可显著改善患者外周血细胞表型 ,具有一定的疗效。结论 :TIL在体外经rIL 2扩增后 ,免疫活性有明显提高。体内肿瘤细胞的消退可能主要并不是通过输入的TIL直接杀伤肿瘤细胞 ,而是在很大程度上依靠其分泌多种细胞因子增强了机体细胞免疫活性和免疫调节能力。TIL辅助其它疗法可成为晚期卵巢癌患者的一种有效治疗手段。

MTT比色法检测脐血LAK和TIL细胞活性

介绍以ＭＴＴ比色法检测脐血淋巴因子激活的杀伤细胞（脐血ＬＡＫ）和肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）活性方法的建立。初步研究不同效靶细胞比例、杀伤时间、ＭＴＴ反应时间和靶细胞传代时间对脐血ＬＡＫ和ＴＩＬ细胞活性检测结果的影响以及ＴＩＬ细胞对自体肿瘤细胞和Ｋ５６２细胞的杀伤活性。实验结果表明本法具有操作简单、灵敏度高、重复性好等优点。

胃肠道肿瘤浸润淋巴细胞的表型与细胞毒活性

作者旨在分析胃肠道肿瘤ＴＩＬ的表型和细胞毒活性及其相关关系。实验发现，新鲜分离的ＴＩＬ杀伤活性较低，ＣＤ３＋、ＣＤ４＋；及ＣＤ８＋细胞比例较低；经ｒＩＬ—２刺激后，ＴＬＬ的细胞毒活性显著增强，尤其对自体瘤细胞显示特异性杀伤活性，各Ｔ细胞亚群比例明显上升。多因素相关分析表明，ＴＩＬ的细胞毒活性与其ＣＤ３＋细胞比例的相关关系具显著性意义（Ｐ＜０．０５），与ＣＤ８＋亚群比例的相关关系亦有显著性意义（Ｐ＜０．０５），而与ＣＤ４＋亚群比例的相关关系无显著意义。证实，ＴＩＬ细胞毒活性与其ＣＤ３＋和ＣＤ８＋细胞的比例密切相关。

上海地区麻鸭血中DHBV及其形态学的研究

本文应用电镜等方法对上海地区麻鸭中鸭乙型肝炎病毒(DHBV)及其形态学进行了研究。104只麻鸭血清标本DHBV阳性率为68.5%,其中1日～1月龄组为93.3%,6～12月龄组为72.7%,1～2年龄组为56.6%,表明DHBV阳性率随鸭龄增长而不断下降。鸭血清中除存在DHBV的40～45nm完全颗粒与40～60nm空心颗粒外,还发现一种20～30nm的小球形颗粒。鸭肝组织超薄切片的电镜观察,在肝细胞浆内质网中找到DHBV颗粒,同时在胞浆与核内均找到35～37nm裸露的核心颗粒。

脐血淋巴细胞生物性状的初步观察

为了开发利用正常胎儿脐血作为淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ）免疫治疗的细胞来源。本实验研究了脐血淋巴细胞的增殖能力、ＮＫ活性及细胞表型等。研究发现１．脐血淋巴细胞含量多、得率高和增殖快；２．脐血淋巴细胞增殖和分化表明：体外培养初期（７ｄ以内）其ＮＫ活性很低，经白细胞介素－２（ＩＬ－２）刺激培养１周后ＮＫ活性从２７．９％提高至７９．６％（Ｐ＜０．０５）。同样脐血淋巴细胞在培养初期较为幼稚，通过体外经ＩＬ－２等刺激后渐趋成熟，比例明显升高，分别为７６．４％、１３．６％、７０％和８５％，表明脐血可作为ＬＡＫ细胞的重要来源。

胃肠道肿瘤取材的TIL细胞的得率和活力

为了获得数量更多、活力更强的肿瘤浸润淋巴细胞ＴＩＬ，就胃肠道肿瘤不同取材部位进行了研究。分析比较了取自癌肿组织的浸润结节、实质部位和中央区域的ＴＩＬ细胞得率与活力。结果发现，中央区域的淋巴细胞得率最低，为６．３×１０５细胞个／ｇ，而肿瘤浸润结节与实质部位得率相似，分别为９．１５×１０５细胞个／ｇ和９．６１×１０５细胞个／ｇ方差分析Ｐ＜０．０５；两两比较，中心区域与结节区、实质区比较Ｐ＜０．０５。活力比较，肿块表面结节的淋巴细胞活力最高，实质部位次之，中心区域活力最差。经综合分析，认为胃肠道肿瘤取材部位，以肿瘤表面浸润结节最好。

受体介导TNFα基因转移的实验研究

目的检测受体介导基因转移人肿瘤坏死因子α基因的靶向性和表达效率。方法人转铁蛋白同多聚赖氨酸共价交联，盐键合成交联蛋白和外源基因质粒的超分子复合物，对表达转铁蛋白受体的肿瘤细胞株进行β－半乳糖苷酶和人肿瘤环死因子α基因转移。结果检测到外源基因表达；转染人肿瘤坏死因子α基因后细胞上清液检测到一过性人肿瘤坏死因子α活性升高。结论受体介导基因转移具有良好的靶向性，但表达效率低。

TIL不同治疗途径的疗效分析

通过不同途径(局部/介入法,静脉滴注法)注射肿瘤浸润淋巴细胞,比较其有效率、一年生存率。发现局部/介入法的有效率(85.7％)高于静脉滴注法(48.6％),而前者的一年生存率低于后者,局部/介入、静脉滴注一年生存率分别为66％、80％。分析其原因,发现静脉滴注后肿瘤患者外周血中的CD3^+,CD4^+、CD8^+均明显提高,增多率高于局部注射法,但静脉滴注法和静脉+局部的增多率相似(P>0.05)。提示:静脉滴注能提高肿瘤患者的全身细胞免疫功能而使一年生存率提高。

不同来源的TIL临床应用研究

以５１例晚期肿瘤患者作为研究对象，对其不同来源的肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）进行治疗研究，发现肿瘤组织来源的ＴＩＬ其有效率及一年生存率明显高于胸腹水及转移淋巴结的ＴＡＬ；其中肿瘤组织的ＴＩＬ，胸腹水、转移淋巴结的ＴＡＬ有效率分别为８０．９％、４０．０％、４６．６％；三者治疗肿瘤患者的一年生存率分别为８１．０％、４６．７％、６０．０％；另外发现胸腹水ＴＡＬ对实质性肿块治疗疗效较低，为４０％，其中静脉滴注更差，为１４．２％，而介入注射与局部治疗较好，为６２．５％；胸腹水ＴＡＬ对癌性胸腹水有一定疗效，以胸腹腔注射为最佳注射途径，消退率为７４％，高于静脉滴注２８．５％；对胸腹水治疗后不消退者进行分析，可能与肿瘤患者的病情有关，影响了ＴＡＬ的吸收。提示治疗实质性肿瘤以ＴＩＬ效果较佳，而ＴＡＬ对胸腹水有一定疗效，且以胸腹腔注射为最佳治疗途径。

恶性脑肿瘤浸润淋巴细胞的临床应用研究

用冷酶法对７例脑恶性肿瘤进行肿瘤浸润淋巴细胞分离、培养并用于临床。７例肿瘤的ＴＩＬ扩增倍数均大于刚分离时的５００倍，其中２例大于１０００倍，另２例分别大于２０００及３０００倍；ＴＩＬ的表型检测ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＨＬＡ－ＤＲ分别为９７％，３５％，５４％，９７％；电镜观察到ＴＩＬ先靠近肿瘤细胞，伸出触手，接触肿瘤细胞膜上，随后肿瘤细胞破坏、死亡的过程。临床应用ＴＩＬ后随访至今９ｍｏ，７例肿瘤患者中，１例转移性腺瘤因全身衰竭于手术后５ｍｏ死亡，另１例术后６ｍｏ复发，其他患者无复发。

卵巢癌TIL体外研究

为了提高肿瘤浸润淋巴细胞治疗卵巢癌的临床效果，本实验分析研究了卵巢癌ＴＩＬ细胞存活天数与细胞增殖能力、细胞表型及杀伤力之间的关系，发现ＴＩＬ细胞第１５天出现增殖，至２５天达到高峰，４０天左右开始增殖缓慢；培养２０天的ＴＩＬ细胞表型中ＣＤ＿３、ＣＤ＿４、ＤＲ明显高于１０天的ＴＩＬ细胞，其中ＴＩＬ的ＣＤ＿３为８６．２％，ＣＤ＿４、ＤＲ也较高，分别为５５．６％，９３．１％，ＴＩＬ培养至３０天，其细胞表型变化幅度较小；培养至２０天的ＴＩＬ细胞已达较高的杀伤活性。提示培养２０～４０天的ＴＩＬ细胞比较适合临床应用。

不同取材部位的TIL得率及活力研究

为了获得更多、活力更强的ＴＩＬ细胞，本实验就实体瘤肝癌、肺癌及卵巢癌取材部位进行了分析，比较了取自肝癌、肺癌组织的浸润结节、交界组织、实质部位、中心及坏死区域的得率与活力，结果发现：坏死部位的细胞得率与活力最差，淋巴细胞得率也最差，肝癌、肺癌组织分别为４．０５×１０￣４／ｇ、５．５×１０￣４／ｇ；中心部位较差，分别为３．６×１０￣５／ｇ、４．１９×１０￣５／ｇ；实质部位的细胞得率最高，淋巴细胞得率最多，肝癌、肺癌组织分别为１．５９８×１０￣６／ｇ，９．０５×１０￣５／ｇ；表面浸润结节及交界组织淋巴细胞得率及活力较好，在肺癌组织分别为７．８７×１０￣５／ｇ、７．０４×１０￣５／ｇ，在肝癌组织分别为８．４×１０￣／ｇ、１．２２９×１０￣／ｇ，故认为肝癌、肺癌组织以浸润结节、交界组织及实质部分较好。对于卵巢癌肿块，分析其浸润结节、实质部位及卵泡部位，其中表面浸润结节最后为７．２４７×１０￣５／ｇ，其次为实质部位为２．４９９×１０￣５／ｇ，而卵巢组织最差为２．０１７×１０￣５／ｇ，故认为卵巢肿瘤的取材以表面浸润结节为最好。

卵巢癌浸润淋巴细胞的免疫学特性研究

目的 研究卵巢癌浸润淋巴细胞（ＴＩＬ） 在体外扩增后免疫学特性，评估ＴＩＬ用于晚期卵巢癌治疗的前景。 方法 利用流式细胞仪分析ＴＩＬ的细胞表型，使用分子生物学和免疫学方法研究ＴＩＬ分泌细胞因子的能力和杀伤肿瘤细胞的活性。 结果 ＴＩＬ细胞表型的差异可能与肿瘤的种类、性质、取材部位有关，结缔组织，基质中来源的ＴＩＬ以ＣＤ＋３ 、ＣＤ＋４ 为主，肿瘤组织和小血管周围以ＣＤ＋３ 、ＣＤ＋８ 为主，体外ＩＬ２ 的浓度对ＴＩＬ的免疫学特性有很大的影响。经ｒＩＬ２ 扩增后，ＴＩＬ分泌产生ＩＬ２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ等多种细胞因子能力及杀伤肿瘤细胞的活性均有明显提高。再加入抗ＣＤ３ 单抗或ＰＨＡ（ 合适浓度），ＴＩＬ细胞因子表达可进一步增强。ＴＩＬ联合环磷酰胺或ＩＬ２ 治疗晚期卵巢癌患者，可显著改善患者外周血细胞表型，具有一定的疗效。 结论 ＴＩＬ在体外经ｒＩＬ２ 扩增后，免疫活性有明显提高。体内肿瘤细胞的消退可能主要并不是通过输入的ＴＩＬ直接杀伤肿瘤细胞，而是在很大程度上依靠其分泌多种细胞因子增强了机体细胞免疫活性和免疫调节能力。

卵巢癌TIL细胞杀伤活力的研究

本实验以卵巢浆液性囊腺癌及粘液性腺腺癌ＴＩＬ细胞作为效应细胞，卵巢浆液性细胞及Ｋ５６２细胞作为靶细胞，采用单个细胞毒实验法，连续观察了效应细胞和靶细胞的结合及杀伤过程，发现ＴＩＬ杀伤Ｋ５６２细胞及新鲜分离的肿瘤细胞具有相似的形态变化过程，但是变化速度存在着差异，其中浆液性囊腺癌ＴＩＬ细胞杀伤自体肿瘤细胞形态变化最快，其次是杀伤异体同一组织类型细胞，最差的粘液性囊腺癌的ＴＩＬ细胞杀伤异体浆液性囊腺癌细胞，这有助于指导临床治疗。