多形拟杆菌α-L-鼠李糖苷酶序列分析与酶学性质

α-L-鼠李糖苷酶在生物技术领域具有很好的生物催化应用前景。目前,仅16个细菌源GH78家族α-L-鼠李糖苷酶基因被报道,对α-L-鼠李糖苷酶的序列特征与分子催化机制了解尚不完善。人体肠道细菌多形拟杆菌可利用多种多糖与糖苷,其基因组包括6个预测的α-L-鼠李糖苷酶基因,本文集中于连续定位于一个基因座的2个α-L-鼠李糖苷酶基因BtRha78D和BtRha78E,通过研究二者的序列特征和酶学特性旨在确定此基因座的生物学意义。序列分析显示,BtRha78D和BtRha78E的序列组成与长度差异性大,与已发现的α-L-鼠李糖苷酶序列一致性较低,分子进化关系也较远;酶学性质研究表明,BtRha78D和BtRha78E可高效水解底物p NPR,最适p H分别为p H6.0与p H 7.0。BtRha78E在p H 7.5~8.0范围内,仍能保持52%以上的活性。BtRha78D和BtRha78E最适温度为50℃,对pNPR的kcat分别为14.78 s-1和5.48 s-1,Km分别为0.14 mmol/L和0.44 mmol/L,kcat/Km分别为105 600 s-1L/mol和12 500 s-1L/mol。BtRha78D和BtRha78E耐受低浓度(1%)有机溶剂,10%浓度显著降低酶活性,对二甲亚砜具有很好的耐受性,10%浓度下仍能分别保持42%和53%的活性。本研究揭示,α-L-鼠李糖苷酶BtRha78D和BtRha78E间的序列组成与长度差异性很大,具有相同的催化活性而酶学性质却不同,一个包含2个α-L-鼠李糖苷酶基因的基因座可能参与多形拟杆菌降解利用含α-L-鼠李糖基的多糖与糖苷化合物。

10-羟基喜树碱的光谱性质、抗肿瘤活性及应用于细胞标记研究

通过紫外-可见光谱、荧光光谱和红外光谱等方法研究了药物10-羟基喜树碱(HCPT)的光谱性质.采用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)法测定了HCPT对3种肿瘤细胞(HeLa,MCF-7和HT1080)的抗肿瘤活性,其IC50值分别为16.37,16.73和19.24μg/mL.测定了HCPT对正常细胞人胚肾细胞系HEK293T的生长抑制活性,最高抑制率达88.72%,表明正常细胞比3种肿瘤细胞对药物HCPT更敏感.以HeLa细胞为模型,利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒研究了HCPT的抗肿瘤作用机制,发现几乎所有细胞均同时被Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色,细胞膜为绿色,而细胞核为红色,表明HCPT诱导了HeLa细胞的晚期凋亡.通过荧光显微镜观察了HCPT在HeLa细胞中的分布,为其在细胞标记中的应用提供了科学依据.

传统发酵蔬菜微生物群落结构分析

以市售9种发酵蔬菜为对象,采用聚合酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)指纹图谱技术,进行了样品中微生物群落多样性分析、主成分聚类分析(PCA)和优势条带的序列分析。结果表明:货架期内,泡菜、榨菜、酱菜和酸菜等不同加工工艺对发酵蔬菜的多样性和群落结构有显著影响。相同工艺的发酵蔬菜样品,细菌多样性指数差异不大,PCA分析聚为一类。不同加工工艺、包装工艺、不同原料的发酵蔬菜中,存在着丰富的乳杆菌群。植物乳杆菌存在于所有发酵蔬菜中,短乳杆菌为泡菜和酸菜的优势菌群,弯曲乳杆菌在泡菜和浙江榨菜中为优势菌群,消化乳杆菌和食用糖乳杆菌分别为酸菜和酱菜的优势菌群。此外,在散装榨菜和散装酱菜中检测到嗜冷杆菌;两种不同产地的酸菜中均含有产气肠杆菌;9号酸菜中还含有摩根菌;4号榨菜中含有嗜盐杆菌。以上几种细菌均属于有害菌或条件治病菌。综上所述,除3种泡菜外,其它榨菜、酱菜和酸菜等均发现有害菌或条件致病菌,对于这些有害菌应进一步研究,确定其属于生产过程还是储存过程的污染,从而为食品安全提供依据。

水杨酸铬(Ⅲ)配合物对肥胖小鼠肠道菌群的影响

目的探讨水杨酸铬(Ⅲ)配合物{[Cr(Ⅲ)(5-Cl-SA)(en)2]Cl·2H2O·2CH3OH}对肥胖小鼠的减肥效果和对小鼠肠道菌群结构的影响。方法昆明种小鼠随机分为正常组、模型组和药物组,定期称重并收集其粪便;给药9周后,解剖小鼠并测定多项生理生化指标;提取粪便微生物总DNA,PCR扩增16S rDNA V3可变区,并行变性梯度凝胶电泳(DGGE),分析肠道微生物多样性,利用主成分分析(PCA)研究肠道微生物群落组成的变化。结果水杨酸铬(Ⅲ)配合物可显著控制小鼠体重增长,且有减肥功效;给药9周后,小鼠各项生理指标均趋于正常。PCR-DGGE指纹图谱分析结果显示,高脂饲料和受试药物对肠道微生物的多样性影响不大,但对菌群结构影响显著。结论本研究为开发新型减肥药物提供了依据。

基于宏基因组学方法挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶资源

α-L-鼠李糖苷酶是特异性切割末端含α-L-鼠李糖的天然化合物的一类糖苷水解酶,该酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。本研究旨在利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法,从提取的健康人体粪便宏基因组DNA中获得新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。通过对CAZy数据库GH78家族中193条细菌源α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列进行多重序列比对,首次将α-L-鼠李糖苷酶家族分为3个亚家族,并确定了其中两个亚家族的两对保守氨基酸基序。基于保守基序氨基酸序列设计简并引物,PCR扩增保守基序间基因片段,对PCR产物克隆测序,结果获得12条α-L-鼠李糖苷酶基因片段,对其编码的氨基酸序列在Gen Bank数据库进行Blast序列比对,其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52%,一条为73%,其余9条在94%以上。根据Gen Bank数据库中序列一致性94%以上片段对应全长基因序列设计上下游引物,以人体粪便宏基因组DNA为模板,扩增获得3条α-L-鼠李糖苷酶全长基因,并将其克隆于载体p ET-28a,在E.coli BL21(DE3)内进行异源表达,目的蛋白多以包涵体形式存在于沉淀中,少量以可溶性形式存在于上清中。人体肠道细菌宏基因组为新型α-L-鼠李糖苷酶基因发现提供了潜在的基因资源库,基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法,从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。

人源肠道菌中转化连翘苷制备连翘脂素的菌株筛选及固定化

为了实现生物转化连翘苷制备连翘脂素,本文以连翘脂素得率为指标,采取涂布平板法和16S rDNA测序对人源肠道菌中可以转化连翘苷生成连翘脂素的菌株进行了筛选和鉴定;为了提高菌株的使用稳定性和效率,利用微生物固定化技术,优化了固定化菌球的制备工艺以及转化连翘苷制备连翘脂素的工艺条件。从人源肠道菌中筛选到一株菌为肠杆菌科埃希氏属大肠杆菌(Escherichia coli),该菌株可高效转化连翘苷生成连翘脂素,且无副产物的生成。优化的固定化菌球制备工艺条件为:海藻酸钠浓度3%、氯化钙浓度3.5%、交联时间3 h。固定化菌球在pH值为8、底物浓度为0.8 mg/mL、温度为39℃的条件下,连翘苷在25 h左右可完全转化生成连翘脂素,连翘脂素的平均得率可达97.0%。并且固定化菌球循环使用13次后,连翘苷的转化率仍能达到70.2%。

鼠李糖乳杆菌LGG芳香酯酶的酶学表征与结构分析

为获得新型益生菌酯酶资源,通过挖掘鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus GG,LGG)的基因组信息,对芳香酯酶LggAE进行基因克隆、表达纯化、酶学表征与结构分析。结果表明:LggAE的最适反应pH值为7.5,在pH 7.0~10.0范围内保持75%以上酶活力,最适反应温度为50℃,偏好水解中链对硝基苯酚酯,最适底物为对硝基苯酚辛酸酯,在40℃条件下具有一定热稳定性,乙二醇可提升LggAE 17.3%酶活力,LggAE耐受二甲基亚砜,在较高盐浓度柠檬酸钠和氯化钠存在下能保持39.1%~71.0%酶活力,脱氧胆酸钠在高温下显著抑制酶活力。结构分析显示LggAE的底物结合口袋呈较小孔洞状,主要由脂肪族氨基酸残基构成。

糖尿病患者肠道中4种重要菌群的定量分析

目的:了解正常人群与Ⅱ型糖尿病人,以及Ⅱ型糖尿病人在是否有家族遗传、是否用药治疗和是否伴随肥胖等情况下肠道中拟杆菌、双歧杆菌、柔嫩梭菌和乳杆菌的含量与变化,为预防和治疗Ⅱ型糖尿病开辟新途径。方法:收集上述各类人群粪便样品(每组10人),分别提取样品中微生物的总DNA,运用荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增4种重要菌群的特异性片段,计算含量,分析上述菌群的变化差异。结果:正常人群肠道中的拟杆菌和双歧杆菌含量均显著低于Ⅱ型糖尿病人群;柔嫩梭菌和乳杆菌含量均显著高于后者。在Ⅱ型糖尿病人群中,用药患者组和肥胖+高血糖患者组的肠道中拟杆菌和双歧杆菌含量均显著低于未用药患者组和单纯高血糖患者组,而柔嫩梭菌和乳杆菌含量均显著高于后者。有无Ⅱ型糖尿病遗传史对患者肠道内4种菌群的含量均无显著影响。结论:4种重要菌群与Ⅱ型糖尿病的发生和发展有密切关系;用药治疗后的患者肠道中4种重要菌群含量比其他各组更接近正常人群;肥胖易加重Ⅱ型糖尿病病情;而有无Ⅱ型糖尿病家族遗传对这4种菌群的含量几乎没有影响。

α-L-鼠李糖苷酶以催化活性包涵体形式异源表达及其酶学性质

从解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)基因组DNA扩增获得两个α-L-鼠李糖苷酶基因PhRha78E和PhRha78G,构建于表达载体pET-28a;将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达,PhRha78E和PhRha78G以不溶性包涵体形式大量表达于沉淀中,每克菌体可分别获得0.42 g和0.39 g含目的酶包涵体的沉淀。酶活实验显示二者的不溶性包涵体具有催化活性,可以催化水解底物对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenol-α-L-rhamnopyranoside,PNPR),表明二者在大肠杆菌中以催化活性包涵体形式异源表达。PhRha78E和PhRha78G的最适反应pH值相近,分别为6.5和7.0,PhRha78E在酸性pH 4.8仍能保持62%酶活力,而PhRha78G在碱性pH 8.6依然保持72%酶活力;PhRha78E和PhRha78G的最适反应温度却相差很大,分别为60℃和40℃,PhRha78E在高温70℃条件下仍能保持69%酶活力,而PhRha78G在低温20℃条件下仍有43%酶活力;动力学常数k_(cat)分别为0.18 s^(-1)和0.12 s^(-1),K_m分别为0.55 mmol/L和0.40 mmol/L。本研究揭示新型α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E和PhRha78G在大肠杆菌中以催化活性包涵体形式异源表达,蛋白表达量大,二者酶学性质差异较大,可应用于不同的生物催化领域,并丰富了现有α-L-鼠李糖苷酶资源库。

荞麦中光毒物质的转化及荞麦光敏素对人结肠癌细胞HCT-116的抑制活性

荞麦光敏素(fagopyrins)具有光毒性和酪氨酸激酶抑制活性,可作为光动力治疗中的光敏剂,用于癌症的治疗。本研究采用电喷雾质谱法和荧光光度法,探究了荞麦中光毒物存在的型式,并分析了光敏素前体(protofagopyrin)转化为荞麦光敏素的条件。通过MTT细胞实验,研究荞麦光敏素提取物对人结直肠癌细胞和人结肠上皮细胞生长增殖的影响。结果表明,荞麦中光毒物以光敏素前体为主,并且有微量的荞麦光敏素,前者质谱的离子强度是后者的400倍。光敏素前体的转化发生在光照提取过程中,而且提取液在光照放置过程中,光敏素前体继续转化,尤其是前0. 5 h对于转化的影响显著超过了提取过程。荞麦光敏素提取物与细胞作用,避光培养时,对HCT-116癌细胞有轻度的抑制作用;而对FHC正常细胞不仅未见抑制还有促进作用。光照结合避光培养时,荞麦光敏素对癌细胞的抑制随着提取物浓度的增加而增强,当提取物浓度达到200μg/m L时,抑制率达到50%;而对正常细胞提取物,浓度低于200μg/m L时未见抑制,500～1 000μg/m L时抑制率达到50%。光敏素提取物与金丝桃素抑制细胞的能力相比,光照结合避光培养时,金丝桃素对正常细胞的抑制作用强于对癌细胞,而荞麦光敏素的提取物正好相反。提示荞麦光敏素比金丝桃素对癌细胞的抑制更具特异性。上述结果为从荞麦叶中开发出有利于肿瘤治疗的药物提供了实验依据。

人粪便宏基因组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质及其对芦丁的生物转化

HFM-rha78是本实验室从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。该基因全长2 166 bp,编码蛋白质分子质量为83 kD,等电点5. 58,其二级结构以α螺旋和无规卷曲为主,整体表现出亲水性,其氨基酸序列与GenBank收录的序列一致性仅为48%。系统进化树表明,该酶被分类至亚家族Ⅱ,其催化广义酸和广义碱均为谷氨酸,催化残基高度保守。为明确其酶学性质,以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR)为底物,通过紫外-可见分光光度法测定产物对硝基苯酚的生成量,得到HFM-Rha78的最适反应温度为50℃,最适pH为6. 5,且在30～46℃下保温30 min,不影响活力。为初步研究其对芦丁的水解能力,首先对HFM-Rha78的有机溶剂耐受性进行了研究。结果表明,该酶能普遍耐受1%的有机溶剂,甚至1%～5%的异丙醇和1%的β-巯基乙醇,有提高其活性的能力。当DMSO浓度为10%时,仍能保持79%的酶活性。HFM-Rha78对底物pNPR的V_(max)为129. 9μmol min-1mg^(-1),HFM-Rha78的KM较大,为26. 0 mmol L^(-1)。转换数k_(cat)为185. 1 s^(-1),催化效率k_(cat)/KM为7. 1×103s^(-1)mol^(-1)L。采用高效液相色谱仪检测HFM-Rha78水解芦丁的能力。结果表明,37℃条件下,随着酶浓度和水解时间增加,芦丁转化率增大。反应10 h时,芦丁转化率达41. 8%。本研究获得了HFM-Rha78的最适反应条件,并确定其可特异性生物转化芦丁为异槲皮素。

模拟人体胃肠道环境筛选益生乳杆菌

【目的】筛选具有益生特性的乳杆菌作为保健型酸奶的候选菌株。【方法】从健康人肠道和奶豆腐中分离筛选出耐受人工胃液的乳杆菌,对其进行体外益生特性(人工胃肠液耐受性、胆盐耐受性、抑菌活性及胆固醇降解能力)研究。【结果】从在乳杆菌分离培养基上有溶钙圈的41株菌株中筛选出5株耐酸、耐人工胃液较强的菌株,经16S rR NA基因测序鉴定,其中3株为乳杆菌,分别命名为植物乳杆菌Lp MT-3、植物乳杆菌Lp MT-5和唾液乳杆菌LsA F-7。在人工胃液中3株菌的耐受力均强于商品化的对照菌株LGG(鼠李糖乳杆菌GG);转入肠液4 h后直至26 h,Lp MT-5存活率基本稳定在45%左右,仅次于LGG。胆盐浓度为0.10%时,3株乳杆菌的耐胆盐能力均强于LGG;胆盐浓度为0.20%时,Lp MT-3和LsA F-7仍能存活。3株乳杆菌均具有抑菌活性,对粪肠球菌的抑制最明显,其次是金黄色葡萄球菌,对大肠杆菌、沙门氏菌的抑制作用较差。3株乳杆菌对胆固醇的清除效力依次为Lp MT-3>LpM T-5>Ls AF-7;清除率依次为Ls AF-7>Lp MT-3>LpM T-5。【结论】筛选出3株适应人体胃肠液环境、耐胆盐、抑菌及降胆固醇活力强的乳杆菌,可作为进一步开发新的益生菌产品和保健型酸奶的菌株。

矿区不同植被复垦模式对土壤细菌群落结构的影响

以安太堡露天煤矿复垦区为研究对象,用PCR-DGGE技术分析不同复垦植被(榆树、落叶松、杏树、云杉和刺槐)及复垦年限(15年和20年)对土壤细菌的影响.土壤细菌多样性分析结果表明:复垦20年组,榆树最高,杏树最低,其余3个植被无显著差异;复垦15年组,云杉显著高于刺槐;刺槐随复垦年限延长,其土壤细菌多样性显著增高,而云杉却反之.相似性系数分析、聚类分析和PCA均显示,相同复垦年限的土样细菌群落结构相似性高.相关性分析表明细菌多样性指数和土壤pH显著正相关.优势和差异条带测序鉴定出Nitrospira、Sphingomonas、Arthrobacter、Brachybacterium、Rhizobium以及Mesorhizobium等或参与氮循环、或降解多环芳烃及杂环有机物的细菌属.本研究说明榆树和云杉有利于土壤细菌多样性的恢复;复垦区土壤的优势菌群多为有利于污染土壤的生态修复和肥力恢复的功能细菌属.

3种熟化方式对黑豆花青素含量的不同影响

黑豆,又名乌豆,豆目,蝶形花亚科,为药食同源作物。黑豆中蛋白质高于黄豆,人体不能自身合成的必需脂肪酸-亚油酸和亚麻酸高于其他豆类[1]。黑豆中灰分含量,即微量元素锌、铜、镁、硒、磷等含量都很高,并且含丰富的VA、VE、核黄素、黑色素等[2]。此外,黑豆亦还富含大量的花青素。花青素具有很强的抗氧化活性,是一种优良的天然抗氧化剂和自由基清除剂[3]。有文献报道,黑豆具有预防动脉血管硬化、