杂交种“豫烟11”赖百当二萜含量和腺毛密度的定向改良

【背景和目的】豫烟11是由8306与MSK326杂交而来的烤烟品种,因其父本8306腺毛分泌物中含有赖百当二萜而具有晾晒烟的香气特征。为彰显豫烟11的烤烟特色香气风格,对其腺毛分泌物的含量和组成进行定向改良。【方法】利用8306-1(NtCPS2敲除的8306)与MSK326杂交获得豫烟11-1,利用8306-2(NtCPS2、NtCycB2共同敲除的8306)与HK326(NtCycB2敲除的K326)杂交获得豫烟11-2,对其农艺性状、腺毛形态和腺毛分泌物进行测定,并对相关基因序列及表达水平进行分析。【结果】(1)分子检测表明,豫烟11-1、豫烟11-2中的NtCPS2均为突变型;豫烟11-1中的NtCycB2为野生型,而豫烟11-2中的则为突变型。(2)田间试验表明,豫烟11-1、豫烟11-2生长发育正常,农艺性状与豫烟11基本一致;豫烟11-1腺毛密度与豫烟11相比无显著差异,豫烟11-2腺毛密度比豫烟11提高了40.6%;豫烟11-1、豫烟11-2腺毛分泌物中均不含有赖百当二萜,豫烟11-1腺毛分泌物含量与豫烟11相比无显著变化,豫烟11-2腺毛分泌物含量比豫烟11提高了70.2%。(3)qRT-PCR分析表明,豫烟11-1中二萜合成相关基因NtCPS2、NtABS、NtCBTS、NtCYP71D16的表达量与豫烟11相比无显著差异,但在豫烟11-2中则显著提高,而二萜合成上游基因NtGPPS、NtGGPPS的表达量在3个株系间无显著变化。【结论】本研究利用NtCPS2和NtCycB2基因突变,实现了豫烟11腺毛密度、腺毛分泌物组分和含量的定向改良,为针对上述性状的分子育种提供了范例。

烟草“8306”NtCPS2基因敲除及叶面化学成分改良

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致翻译提前终止的纯合突变体8306-1。与8306相比,该突变株系生长发育正常,腺毛类型和腺毛密度无显著变化;利用GC-MS技术对叶面化学成分进行检测,在8306-1中并未发现8306中所含有的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物,而腺毛分泌物的其他主要成分,如西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及蔗糖酯的含量与对照相比并无明显变化;RT-PCR检测分析显示,8306-1与8306中MEP途径及二萜生物合成途径的关键基因,如NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtGPPS、NtGGPPS、NtCYC、NtCYP71D16等在转录水平上的表达均无明显差异。该研究结果表明,NtCPS2基因敲除能有效降低烟草赖百当类二萜化合物的含量,而对叶面其他化学成分及类萜途径基因表达无明显影响。因此,NtCPS2基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点,对烤烟高香气育种具有重要意义。

高分泌型无赖百当烟草8306突变材料的创制与分析

8306是具有晾晒烟风格的烤烟育种材料。在前期试验中创制了NtCPS2基因突变株系8306-1,抑制了晾晒烟风格代表性物质赖百当二萜的合成。为进一步提高8306-1株系中西柏烷二萜和蔗糖酯含量(质量分数),采用基因编辑技术对8306-1株系的NtCycB2基因进行敲除,获得了纯合突变株系8306-2。与8306、8306-1株系相比,8306-2株系生长发育正常,农艺性状无显著差异。8306-2株系中长柄分泌型腺毛密度显著高于8306和8306-1株系,且存在较多的分枝型腺毛。8306-2与8306-1株系腺毛分泌物组成成分相同,均缺少8306中的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物;且8306-2株系叶面化学成分含量(质量分数)比8306和8306-1株系显著提高,其中西柏烷二萜含量分别提高95.7%和93.4%,蔗糖酯含量分别提高60.8%和62.5%。qRT-PCR检测分析发现,8306-2株系中NtCBT、NtCYP71D16、NtCPS2和NtABS 4个二萜合成关键酶基因的表达水平显著高于8306-1和8306株系,而二萜合成的上游基因NtGPPS和NtGGPPS的表达无显著变化。表明8306株系中NtCycB2基因和NtCPS2基因的共敲除,在有效抑制赖百当类物质合成的基础上显著增加了烟草腺毛密度和腺毛分泌物含量。