目的·探究黏蛋白1(mucin 1,MUC1)调控肿瘤细胞增殖、迁移和干性维持的功能位点。方法·通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析寻找MUC1基因在不同癌症中的突变特征,对不同MUC1突变位点进行分析及定位,...目的·探究黏蛋白1(mucin 1,MUC1)调控肿瘤细胞增殖、迁移和干性维持的功能位点。方法·通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析寻找MUC1基因在不同癌症中的突变特征,对不同MUC1突变位点进行分析及定位,并按突变出现频率排序;通过Western blotting筛选出突变频率较高且蛋白稳定表达的MUC1突变体,利用乳腺癌细胞株BT549敲除MUC1细胞系和乳腺非转化细胞株MCF-10A,应用慢病毒表达系统构建MUC1野生型(MUC1-WT)和突变体稳定表达的细胞系。采用免疫荧光法检测不同MUC1突变体的细胞定位。以MUC1-WT为阳性对照、MUC1-AQA功能丧失突变体为阴性对照,对不同突变细胞的肿瘤生物学功能进行分析:通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)及克隆形成实验检测细胞增殖能力;通过划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移能力;通过成球实验检测细胞干性。使用PyMOL软件分析MUC1突变体结构定位并通过蛋白质对接软件(ZDOCK Server)进行分子对接分析。结果·在TCGA数据库中得到102个位于MUC1编码区的突变,其中P418S、S251R、V359I、N271S、N465H 5个错义突变出现频率较高且位于非数目可变串联重复序列(non-variable number of tandem repeats,non-VNTR)区域。进一步检测发现MUC1-S251R、N271S、V359I突变体可稳定表达;细胞定位分析发现这3个突变体主要分布于细胞质,同时细胞核也有一定的分布,核质比与野生型未见明显差异。表达不同MUC1突变体细胞的肿瘤生物学功能分析发现:①MUC1-WT高表达显著增强BT549和MCF-10A细胞的增殖能力;与MUC1-WT细胞相比,MUC1-AQA、S251R、N271S突变体细胞增殖能力下降,但MUC1-V359I突变体细胞与MUC1-WT细胞具有相似的增殖能力。②MUC1-WT高表达细胞的迁移能力显著增强,而MUC1-AQA细胞迁移能力减弱。在BT549细胞中,MUC1-S251R与MUC1-V359I突变体细胞迁移能力与MUC1-WT细胞相似,但MUC1-N271S细胞的迁移能力较MUC1-WT细胞降低。在MCF-10A细胞中,MUC1-N271S与MUC1-V359I细胞的迁移能力接近MUC1-WT细胞;但MUC1-S251R细胞较MUC1-WT细胞迁移能力显著下降。③MUC1-WT高表达显著增强2种细胞的干性,而MUC1-AQA细胞干性丧失;MUC1-N271S、V359I与MUC1-WT具有相似的维持细胞干性的能力,而MUC1-S251R使细胞干性减弱。PyMOL软件分析结果显示,MUC1-N271S及V359I位于海胆精子蛋白-肠激酶-聚集蛋白(sperm protein-enterokinase-agarin,SEA)区域及附近,分别处于loop区及β-折叠处;分子对接结果显示,MUC1-WT及V359I与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)胞外域形成复合物的稳定性强于MUC1-N271S和S251R,其稳定性排序为V359I>WT>N271S>S251R。结论·MUC1突变体对肿瘤细胞的生物学功能具有不同影响,其对增殖能力影响可能与EGFR信号通路相关。MUC1-V359I与MUC1-WT相似,并未影响MUC1对肿瘤细胞增殖、迁移及干性维持的作用;而MUC1-S251、N271位点可能参与细胞增殖和迁移的信号通路调控且MUC1-S251位点对维持细胞干性较为重要。展开更多
文摘目的·探究黏蛋白1(mucin 1,MUC1)调控肿瘤细胞增殖、迁移和干性维持的功能位点。方法·通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析寻找MUC1基因在不同癌症中的突变特征,对不同MUC1突变位点进行分析及定位,并按突变出现频率排序;通过Western blotting筛选出突变频率较高且蛋白稳定表达的MUC1突变体,利用乳腺癌细胞株BT549敲除MUC1细胞系和乳腺非转化细胞株MCF-10A,应用慢病毒表达系统构建MUC1野生型(MUC1-WT)和突变体稳定表达的细胞系。采用免疫荧光法检测不同MUC1突变体的细胞定位。以MUC1-WT为阳性对照、MUC1-AQA功能丧失突变体为阴性对照,对不同突变细胞的肿瘤生物学功能进行分析:通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)及克隆形成实验检测细胞增殖能力;通过划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移能力;通过成球实验检测细胞干性。使用PyMOL软件分析MUC1突变体结构定位并通过蛋白质对接软件(ZDOCK Server)进行分子对接分析。结果·在TCGA数据库中得到102个位于MUC1编码区的突变,其中P418S、S251R、V359I、N271S、N465H 5个错义突变出现频率较高且位于非数目可变串联重复序列(non-variable number of tandem repeats,non-VNTR)区域。进一步检测发现MUC1-S251R、N271S、V359I突变体可稳定表达;细胞定位分析发现这3个突变体主要分布于细胞质,同时细胞核也有一定的分布,核质比与野生型未见明显差异。表达不同MUC1突变体细胞的肿瘤生物学功能分析发现:①MUC1-WT高表达显著增强BT549和MCF-10A细胞的增殖能力;与MUC1-WT细胞相比,MUC1-AQA、S251R、N271S突变体细胞增殖能力下降,但MUC1-V359I突变体细胞与MUC1-WT细胞具有相似的增殖能力。②MUC1-WT高表达细胞的迁移能力显著增强,而MUC1-AQA细胞迁移能力减弱。在BT549细胞中,MUC1-S251R与MUC1-V359I突变体细胞迁移能力与MUC1-WT细胞相似,但MUC1-N271S细胞的迁移能力较MUC1-WT细胞降低。在MCF-10A细胞中,MUC1-N271S与MUC1-V359I细胞的迁移能力接近MUC1-WT细胞;但MUC1-S251R细胞较MUC1-WT细胞迁移能力显著下降。③MUC1-WT高表达显著增强2种细胞的干性,而MUC1-AQA细胞干性丧失;MUC1-N271S、V359I与MUC1-WT具有相似的维持细胞干性的能力,而MUC1-S251R使细胞干性减弱。PyMOL软件分析结果显示,MUC1-N271S及V359I位于海胆精子蛋白-肠激酶-聚集蛋白(sperm protein-enterokinase-agarin,SEA)区域及附近,分别处于loop区及β-折叠处;分子对接结果显示,MUC1-WT及V359I与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)胞外域形成复合物的稳定性强于MUC1-N271S和S251R,其稳定性排序为V359I>WT>N271S>S251R。结论·MUC1突变体对肿瘤细胞的生物学功能具有不同影响,其对增殖能力影响可能与EGFR信号通路相关。MUC1-V359I与MUC1-WT相似,并未影响MUC1对肿瘤细胞增殖、迁移及干性维持的作用;而MUC1-S251、N271位点可能参与细胞增殖和迁移的信号通路调控且MUC1-S251位点对维持细胞干性较为重要。