S1PR5激动剂减轻H2O2诱导的脑微血管内皮细胞高通透性及氧化应激损伤

目的鞘氨醇⁃1⁃磷酸酯受体5(S1PR5)在急性缺血性卒中(AIS)血脑屏障氧化应激损伤中的作用及机制尚不清楚。文章旨在探讨S1PR5在小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)氧化应激损伤中的作用及分子机制。方法将bEnd.3细胞分为对照组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+5μmol/L A971432(S1PR5特异性选择性激动剂)组、H_(2)O_(2)+10μmol/L A971432组、H_(2)O_(2)+20μmol/L A971432组。用CCK⁃8法检测细胞活力改变;FITC⁃Dextran渗透法检测血管内皮细胞通透性;Western Blot检测S1PR5、ZO⁃1、VE⁃Cadherin、Occludin、Bax、Bcl2、Caspase⁃3、p⁃Erk1/2、Erk1/2、Nrf2、HO⁃1、SOD1和SOD2的蛋白表达水平;免疫荧光观察ZO⁃1的荧光强度;光学显微镜下观察细胞形态变化;DCFH⁃DA探针法检测细胞活性氧水平。结果Western blot结果显示,与对照组bEnd.3细胞的S1PR5蛋白表达(1.00±0.01)相比,H_(2)O_(2)组(0.59±0.03)明显降低(P<0.01)。与对照组相比,H_(2)O_(2)显著增加血管内皮细胞通透性,减少ZO⁃1、VE⁃Cadherin、Occludin、Nrf2、HO⁃1、SOD1和SOD2蛋白表达以及ZO⁃1荧光强度,降低细胞活力,增加MMP⁃9、Bax/Bcl2、Caspase⁃3、p⁃Erk1/2/Erk1/2的蛋白表达和细胞内总活性氧(P<0.05)。与H_(2)O_(2)组[(75.33±3.76)%]相比,H_(2)O_(2)+10、20μmol/L A971432组[(93.34±0.49)%,(100.60±7.29)%]可以明显逆转H_(2)O_(2)诱导的细胞活力下降(P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+5、10、20μmol/L A971432组的血管内皮细胞通透性显著降低,ZO⁃1、VE⁃Cadherin、Occludin、Nrf2、HO⁃1、SOD1和SOD2蛋白表达和ZO⁃1荧光强度增加,细胞活力增加,MMP⁃9、Bax/Bcl2、Caspase⁃3、p⁃Erk1/2/Erk1/2蛋白表达和细胞内总活性氧降低(P<0.05)。结论A971432选择性激动S1PR5可减轻H_(2)O_(2)诱导的bEnd.3内皮细胞高通透性及凋亡,并可能通过激活Nrf2/HO⁃1通路发挥抗氧化损伤作用。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+10、20μmol/L A971432组可以明显逆转H_(2)O_(2)诱导的细胞活力下降(P<0.05)。

N-乙酰-L-半胱氨酸通过AMPK/mTOR途径激活保护性自噬降低青蒿琥酯诱导的胰腺癌细胞死亡

目的使用活性氧(ROS)清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)探究青蒿琥酯(ART)对胰腺癌(PC)的抑制作用及机制。方法ART干预3种PC细胞系CFPAC-1、Capan-2及BxPC3,通过CCK8法检测细胞活性;Transwell法检测细胞迁移能力;Western blotting检测迁移相关蛋白E钙黏蛋白(E-cadherin)、N钙黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达;ROS探针DCFH-DA检测胞内ROS;用LC3细胞免疫荧光检测胞内自噬小体的形成;加入NAC或自噬抑制剂3-MA后,再通过CCK8法检测细胞活性,Western blotting检测p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p62及LC3Ⅱ/Ⅰ的表达。结果ART以时间、剂量依赖的方式抑制CFPAC-1、Capan-2的生长。200μmol/L ART处理CFPAC-1、Capan-2细胞48 h后,E-cadherin表达显著上调,N-cadherin及Vimentin显著下调,细胞迁移能力降低;ART上调胞内ROS水平,促进细胞自噬小体形成;NAC可逆转ART对CFPAC-1、Capan-2细胞的抑制效应,并上调p-AMPK/AMPK、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ,下调p-mTOR/mTOR的表达,增强细胞自噬水平。3-MA不能逆转ART对PC细胞的抑制效应。结论ART依赖ROS,而非自噬发挥抗胰腺癌效应。NAC通过AMPK/mTOR信号通路激活保护性自噬,削弱ART对PC细胞的抑制。

巨噬细胞迁移抑制因子抑制剂ISO-1对脑缺血再灌注大鼠的影响

目的:探讨巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)对大鼠脑缺血再灌注损伤(I/R)后神经损伤及可能涉及的机制。方法:将42只雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham)、缺血再灌注组(I/R)和MIF抑制剂ISO-1处理组(ISO-1)。利用大脑中动脉阻塞(MCAO)制备大鼠I/R模型。ISO-1组大鼠于再灌注同时腹腔注射ISO-1。采用Garcia评分和平衡木实验评定各组大鼠的神经功能损伤情况。通过2,3,5-三苯四唑氯化(TTC)染色检测大鼠脑梗死体积,Nissl染色观察大鼠神经元形态,TUNEL染色检测神经细胞凋亡情况,并采用免疫荧光染色观察大脑皮层中MIF在胶质细胞纤维酸蛋白(GFAP)、离子钙接头蛋白1(Iba-1)和神经元核抗原(Neu N)的表达变化,通过Western Blot检测MIF、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)在脑组织中表达情况。结果:MIF在MCAO大鼠脑组织梗死周边区明显增加,且主要位于神经元中。与I/R组相比,ISO-1组梗死体积明显减小,神经元凋亡数目显著减少,并能够抑制星形胶质细胞增殖活化,从而改善神经功能的损伤。AMPK、LDHA、PKM-2和GLUT-1蛋白表达上调,表明ISO-1可以促进糖代谢过程。结论:MIF抑制剂ISO-1对MCAO大鼠缺血再灌注后神经功能的恢复发挥重要的正向调控作用,可能与糖代谢相关的分子有关。

韦尼克脑病的诊治进展

韦尼克脑病(Wernicke’s encephalopathy,WE)是一种由硫胺素(维生素B1)缺乏导致的严重的神经系统综合征,其典型的临床表现为突然发生意识改变、眼肌麻痹、共济失调[1]。硫胺素缺乏最常见的病因是慢性酒精中毒,还有很多其他原因如胃肠外科手术、妊娠剧吐和化学疗法等。由于WE发病率较低、临床症状多样,且经典的临床三联征存在于少数患者,使其常常被误诊,导致持久性功能障碍,甚至死亡;其预后取决于能否早期静脉给予硫胺素[2]。

青蒿琥酯对缺血性脑卒中模型大鼠神经元凋亡、炎性反应及小胶质细胞极化的影响

目的:探究青蒿琥酯(artesunate,ART)对大鼠脑卒中后神经元凋亡、炎性反应及小胶质细胞极化的影响。方法:(1)动物实验:将27只雄性SPF级SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组及ART治疗组,每组9只。模型组和ART治疗组大鼠通过大脑中动脉闭塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立脑卒中模型。ART治疗组大鼠于造模前3 d每天单次腹腔注射ART(25 mg/kg),假手术组和模型组注射等体积溶剂。造模24 h后,采用TTC染色评估脑梗死体积,Western blot检测梗死区、半暗带及海马区抗凋亡蛋白Bcl2的表达,TUNEL法检测神经元凋亡,组织免疫荧光观察大脑皮质半暗带区域肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达。(2)细胞实验:培养小胶质细胞BV2,分为对照组、氧糖剥夺/复氧组、氧糖剥夺/复氧+0.05μmol/L ART组、氧糖剥夺/复氧+0.1μmol/L ART组及氧糖剥夺/复氧+0.5μmol/L ART组。通过qRT-PCR检测炎性因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及TNF-α的表达;通过Western blot检测M2型小胶质细胞标志蛋白CD206和ARG1的表达;收集上述各组的BV2细胞培养基作为条件培养基,培养海马神经元细胞HT22,通过CCK8法检测细胞活性。采用GraphPad Prism 7软件进行数据分析,多组间比较采用单因素方差分析,进一步的两两比较采用LSD法。结果:(1)动物实验结果:TTC染色结果显示,ART治疗组大鼠脑梗死体积百分比小于模型组[(23.09±8.51)%,(39.63±5.71)%,t=33.93,P<0.01]。TUNEL染色结果显示,模型组和ART治疗组凋亡细胞数目均高于假手术组[(638.90±177.82)个/mm 2,(72.75±13.21)个/mm 2,(16.16±2.73)个/mm 2,均P<0.05],且ART治疗组凋亡细胞数低于模型组(P<0.05)。Western blot结果显示,模型组的半暗带及梗死区的Bcl2蛋白表达均低于假手术组(均P<0.05)。而与模型组相比,ART治疗组的半暗带、海马区和梗死区的Bcl2蛋白表达均高于模型组(均P<0.05)。组织免疫荧光结果显示,模型组和ART治疗组TNF-α荧光强度均高于假手术组(均P<0.05),而ART治疗组TNF-α荧光强度低于模型组(P<0.05)。(2)细胞实验结果:qRT-PCR结果显示,与对照组相比,氧糖剥夺/复氧组细胞中IL-6、IL-1β及TNF-α的mRNA水平均显著升高(均P<0.05),而氧糖剥夺/复氧+0.05μmol/L ART组、氧糖剥夺/复氧+0.1μmol/L ART组及氧糖剥夺/复氧+0.5μmol/L ART组中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达均显著低于氧糖剥夺/复氧组(均P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组相比,氧糖剥夺/复氧组CD206[(0.85±0.04),(1.07±0.07),P<0.05]表达显著下调;而与氧糖剥夺/复氧组相比,氧糖剥夺/复氧+0.1μmol/L ART组CD206(1.22±0.06)、ARG1(1.35±0.08),及氧糖剥夺/复氧+0.5μmol/L ART组CD206(1.24±0.14)、ARG1(1.14±0.07)的蛋白表达均显著高于氧糖剥夺/复氧组[(0.85±0.04),(0.85±0.05)均P<0.05]。CCK8结果显示,与对照组相比,氧糖剥夺/复氧组细胞活力显著下降(P<0.05)。氧糖剥夺/复氧+0.05μmol/L ART组、氧糖剥夺/复氧+0.1μmol/L ART组、氧糖剥夺/复氧+0.5μmol/L ART组细胞活力均高于氧糖剥夺/复氧组(均P<0.05)。结论:ART可以减少脑卒中后神经元凋亡,降低脑卒中后神经炎性反应,可以促进氧糖剥夺/复氧激活的小胶质细胞BV2向M2型极化。