含内参的登革和寨卡病毒三重RT-qPCR检测方法的建立与评估

目的 本研究旨在建立一种登革病毒以及寨卡病毒并含人类基因为内参的三重RT-qPCR检测方法,可以同时检测出内参、登革病毒以及寨卡病毒。方法 针对登革病毒4种血清型的保守区域和寨卡病毒的NS1基因以及人类各个组织中稳定表达的β-actin基因,设计3组特异性引物和探针。构建4种血清型的登革病毒、寨卡病毒以及β-actin标准质粒作为阳性质控品,采用L_(9)(3^(4))正交实验方法确定最佳反应条件,对其特异性、灵敏性及覆盖面进行验证与临床评估,并与检测登革病毒的商品化试剂盒进行了一致性评估。结果 本实验建立的三重RT-qPCR检测方法与12种相近虫媒病毒无非特异性交叉反应;对登革病毒与寨卡病毒的检测灵敏度分别为2.99和2.18 copies/μL组内和组间重复性变异系数均在1.5%以内;与商品化试剂盒相比较,该检测方法对13株登革流行病毒均可获阳性结果;经过Bland-Altman一致性分析,商品化试剂盒和该方法对临床阳性样本检测结果一致性达到92.59%。结论 本研究建立了一种特异性强、灵敏度高的含内参的登革病毒和寨卡病毒三重RT-qPCR检测方法,可作为登革病毒与寨卡病毒感染者的早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于病毒暴发地区的快速筛查。

I型登革病毒感染后不同病程病毒核酸及其IgM抗体的变化规律

目的探讨I型登革病毒感染后病毒核酸及其IgM抗体在患者体内的变化规律,为指导临床快速、准确地诊断登革热提供理论支持。方法回顾性分析2014年7-11月收集的I型登革病毒感染者临床资料和血清标本,应用实时荧光定量RT-PCR和ELISA法分别检测病毒核酸和IgM抗体,分析不同病程两者的变化规律。结果共检出222例阳性患者,其中病毒核酸阳性137例,IgM抗体阳性146例,两者同时阳性61例。病程急性期(发病1~5 d)病毒核酸阳性率为75%~100%,IgM抗体阳性率在发病第1~2天较低,但第3~5天快速升高至50%~70%;进入恢复期(发病6~10 d)病毒核酸阳性率即快速降低,8 d后仅20%左右,但IgM抗体阳性率显著升高达95%~100%。急性期和恢复期病毒核酸与IgM抗体检测结果构成比差异有统计学意义(χ~2=63.41,P<0.05)。结论 I型登革病毒感染者急性期病毒核酸阳性率在75%以上。恢复期IgM抗体阳性率在95%以上。根据病程合理选择检测方法,可提高登革热的诊断效率。

黄热病毒NS1蛋白的制备及免疫原性鉴定

目的原核系统克隆表达黄热病毒(yellow fever virus,YFV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1),鉴定其免疫原性。方法以YFV-17D疫苗株为模板,常规分子生物学方法构建pQE30-YFV NS1表达载体,原核表达纯化YFVNS1重组蛋白;免疫印记、免疫荧光和酶联免疫吸附实验验证其免疫原性。结果成功构建重组质粒pQE30-YFV NS1,制备纯化可溶性YFV NS1蛋白;该重组YFV NS1蛋白与登革病毒、黄热病毒、乙脑病毒、西尼罗河病毒免疫小鼠腹水及寨卡病毒NS1、YFV NS1蛋白免疫小鼠血清均发生反应,重组YFV NS1蛋白免疫小鼠血清与YFV感染细胞超声上清也发生反应。结论获得高纯度YFV NS1重组蛋白,且具有较好的免疫原性,含天然NS1蛋白表位,为基于NS1黄热病毒早期抗原诊断方法和蛋白功能研究奠定基础。

快速检测流行性乙型脑炎病毒IgG抗体试纸条的制备

目的:制备一种快速检测流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)IgG抗体的试纸条,为其现场检测提供新的工具。方法:采用免疫层析技术,以胶体金标记的金黄色葡萄球菌蛋白A为标记物,将JEV特异性原核表达抗原JEVAg45固化于硝酸纤维素膜上作为检测抗原,以JEV抗体阴性的人IgG抗体为质控,制备胶体金快检试纸条,并对该试纸条的敏感性、特异性、稳定性及临床应用进行评估。结果:该试纸条可检测按1∶10~1∶640稀释的JEV多克隆抗体,且同批次试纸条的检测结果一致。该试纸条与其他13种相近虫媒病毒无交叉反应,与免疫荧光法检测结果的符合率为100%。结论:该试纸条具有较高的敏感性、特异性和稳定性,为基层单位快速筛查流行性乙型脑炎提供了新的技术手段。

基孔肯雅热IgG抗体胶体金快速检测试纸条初步评价

基孔肯雅热由基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)引起,通过蚊虫叮咬在人群中传播,全球约有40个国家流行,其典型临床症状有高热、头痛、肌肉关节痛、出血和出疹等^[1]。我国多为输入性的散发病例^[2]。2010年10月在广东省东莞市首次暴发聚集性疫情^[3],导致数百人发病。本研究基于前期筛选的CHIKV特异性重组抗原CHIK23^[4],采用免疫层析技术建立检测CHIKV IgG抗体的快速检测试纸条,同时对试纸条的性能指标进行初步评定,以期为应对该类疫情提供技术及产品储备。

黄热病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定

制备黄热病毒单克隆抗体并分析其生物学特性,进而筛选出具有杀伤力的中和抗体,为黄热病毒临床检测方法及特效药的研发提供实验室基础。使用乳鼠脑进行黄热病毒的传代扩增,通过常规方法对6~8周龄的BALB/c小鼠进行动物免疫,经细胞融合、免疫荧光检测及有限稀释克隆后,筛选制备黄热病毒单克隆抗体共14株。经ELISA鉴定单抗亚型,发现有2株单抗为Ig G2b亚型,1株为Ig M亚型,1株为Ig G2a亚型,其余均为Ig G1亚型;经免疫荧光法鉴定单抗特异性,发现有12株单抗与所检测的病毒株均无交叉反应;经qRT-PCR方法及免疫荧光法评估单抗细胞上清液及其腹水对黄热病毒的中和作用,发现有3株单抗的中和效果较佳。本研究获得了12株特异性较高的单克隆抗体,其中有3株单抗对黄热病毒具有良好的中和作用。

基孔肯雅病毒免疫球蛋白G抗体酶联免疫吸附实验快检试剂盒的研制与应用

目的研制检测基孔肯雅热免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗体的酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)快检试剂盒,为流行病学调查及实验室诊断提供新的工具。方法以基孔肯雅病毒特异性原核表达抗原pMal-chik23为诊断抗原,以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记抗IgG二抗为显色抗体,正交实验对诊断抗原、待检血清、二抗工作浓度进行优化,并对包被、封闭、孵育及显色等反应条件进行系统优化,在临床大样品评估的基础上,确定ELISA检测的临界值。在此基础上,对ELISA反应的特异性、灵敏性及稳定性进行评估,研制组装检测基孔肯雅热IgG抗体的ELISA快检试剂盒。结果经系统优化,研制、组装了检测基孔肯雅热IgG抗体的间接ELISA快检试剂盒,其最佳反应条件为:1.0μg/mL包被抗原经碳酸盐缓冲液4℃包被24 h,HBV封闭液37℃封闭4 h,待检样品1∶101稀释后,100μL/孔,37℃反应40 min,磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline with tween 20,PBST)洗涤4次,HRP标记兔抗人IgG 1∶20000、HRP标记羊抗鼠IgG 1∶10000稀释后,100μL/孔,37℃反应30 min,PBST洗涤5次,TMB显色液100μL,37℃显色10 min,50μL 20%H2SO4终止反应,双波长450/630 nm测定A450 nm值。试剂盒性能评估结果表明,所研制试剂盒与所试阳性样品检测A450 nm值>0.43,阴性样品检测A450 nm值<0.04,S/N比值>10,与辛德毕斯、盖塔、罗斯河、登革等9种其他相近虫媒病毒均无交叉反应,并具较高稳定性,板内变异系数为0.76%~2.12%,板间变异系数为0.64%~1.85%,批间变异系数为0.83%~2.31%,均小于3%,4℃保存1年性能无明显下降。结论研制了检测基孔肯雅热IgG抗体的间接ELISA快检试剂盒,具备良好的灵敏性、特异性与稳定性。

基孔肯雅病毒定量反转录聚合酶链式反应绝对定量检测方法的建立

目的建立检测基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR快检方法,为其实验室诊断与定量分析提供技术方法。方法基于基孔肯雅及其相近虫媒病毒基因组序列的系统比对分析,筛选、鉴定基孔肯雅病毒特异性核酸序列,并以人GAPDH基因为内参照,设计引物、探针,采用L9(34)正交实验确定最佳反应条件,建立基于TaqMan探针法的基孔肯雅病毒qRT-PCR快检方法,并详细分析所建立方法的灵敏度、特异度、重复性及覆盖面。以克隆的检测靶标核酸片段为阳性品,制作标准曲线,建立绝对定量方法。结果经系统优化,建立了基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR定性、定量检测方法,反应体系包括:基孔肯雅病毒、GAPDH内参照检测引物探针,RT/Taq酶混合液,反应缓冲液及阴阳性参考品。所建立方法与ECSA亚型ROSS株、IOL分支LR2006株,亚洲型181/25株以及2010东莞流行株均可获得阳性结果,而与所试其他18种黄病毒、甲病毒、布尼安属相近虫媒病毒无交叉反应,检测下限为580拷贝/mL。定量分析表明,在5.80×10^(2)~5.80×10^(10)拷贝/mL范围内,检测荧光信号值与模板浓度具备良好线性关系,其R^(2)=0.9995,扩增效率为E=0.91%。重复性实验表明,定量分析的批内变异系数为0.01~0.07,批间变异系数为0.03~0.11。结论建立了基孔肯雅病毒的实时荧光定量RT-PCR定性、定量快检方法,具备较高的特异度、灵敏度与覆盖面,为定性、定量分析提供了新的技术手段。

登革病毒2型型特异性抗原片段的鉴定及其抗体ELISA检测方法的建立

目的筛选、鉴定登革病毒(Dengue virus,DENV)2型(DV2)型特异性抗原片段;建立优化检测DV2抗体的ELISA方法,并进行临床应用验证。方法采用生物信息学方法分析1~4型(DV1~DV4)及其相近虫媒病毒基因组序列,选择预测得分较高且在不同DV2流行株中高度保守的表位;利用pMal-c2x表达系统制备其原核表达抗原,Western blot法分析其免疫原性;建立优化检测DV2抗体的ELISA方法,并验证方法的特异性及灵敏性;应用优化的方法检测33份各型登革热(Dengue fever,DF)确诊患者及30份健康体检人群血清样本。结果经生物信息学分析,预测获得DV2特异性抗原表位12段,预测得分值较高的8段(E123~128、E131~135、E143~149、E223~229、E286~294、E340~347、E383~387及E391~398)重组表达载体经双向测序证实读码框架准确,经Western blot分析,包含抗原位点E143~149区域的融合表达片段D2Ag3仅与DV2多克隆抗体发生免疫反应。ELISA优化条件为抗原包被浓度2μg/mL,4℃包被24 h,37℃封闭2 h;经该方法分析,D2Ag3原核表达抗原与DV2多克隆抗体反应的A450≥1.37,与其他20种多克隆抗体反应的A450均≤0.04,DV2多克隆抗体在40~20480倍稀释范围内,均可获得阳性检测结果。63份临床阳性样本A450>0.32,阴性样本A450<0.12,检测样本/阴性对照比值(sample/negative,S/N)>2.1。结论成功筛选鉴定了DV2型特异性抗原片段,初步建立了DV2 IgG抗体的ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性及灵敏性,为DF的鉴别诊断提供了技术手段。

SARS-CoV-2 S蛋白相关感染致病机制研究进展

严重急性呼吸综合征相关冠状病毒-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)被证实主要通过病毒结构蛋白中的S蛋白与人类细胞表面ACE2受体结合而感染人体。本文针对这一主要的感染机制进行文献调研,从S蛋白结构对感染能力的影响、S蛋白与多种细胞ACE2受体的结合、多种调控蛋白对这一结合过程的影响等方面阐述了SARS-CoV-2感染细胞的可能分子机制,并从S蛋白变异对病毒传染性和致病性的影响等方面加深了对SARS-CoV-2致病性的认识,为进一步全面认识SARS-CoV-2这一病毒提供有益参考。