基于ALKBH5调控GSK3β/mTOR通路抑制过度自噬探讨速效救心丸减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用机制

目的:基于HL-1细胞自噬水平及相关通路关键蛋白表达探讨速效救心丸经Alk B同源蛋白5(ALKBH5)信号转导调控糖原合成酶激酶3β(GSK3β)/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)通路抑制过度自噬而发挥对心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤保护作用的机制。方法:构建慢病毒干扰载体,筛选最佳干扰慢病毒。将HL-1细胞随机分为3组,并进行空白转染、ALKBH5转染、GSK3转染,各组再随机分为4组分别进行缺氧/复氧(模型组)、缺氧/复氧+速效(速效组)、缺氧/复氧+川芎嗪(川芎嗪组)、缺氧/复氧+冰片(冰片组)处理。通过自噬双标腺病毒(m RFP-e GFP-LC3)双荧光染色检测自噬流,细胞计数法(CCK8)检测细胞增殖,双染色双变量流式细胞分析法(Annexin V/PI)检测细胞凋亡,透射电镜观察自噬小体的数量和形态,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测GSK3β、m TOR含量及自噬相关基因(Atg)5、苄氯素1(Beclin1)、自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、自噬标志物p62蛋白表达。结果:ALKBH5过表达可抑制GSK3β表达,增强m TOR表达(P<0.05)。CCK8法检测m RFP-e GFP-LC3的双荧光染色检测自噬流结果显示,与空白转染比较,ALKBH5转染可促进自噬,GSK3β转染可抑制自噬(P<0.05)。CCK8法检测细胞增殖结果显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组均可促进细胞增殖;与空白转染比较,ALKBH5组可抑制细胞增殖,GSK3β可促进细胞增殖(P<0.05)。Annexin V/PI双染色法检测心肌细胞凋亡显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组均可抑制细胞凋亡;与空白组比较,ALKBH5转染及GSK3β转染均可增加细胞凋亡(P<0.05)。Western Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,增强m TOR表达(P<0.05)。与空白转染比较,ALKBH5转染可增强LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,抑制m TOR表达;GSK3β转染可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,增强m TOR表达(P<0.05)。结论:速效救心丸及其有效成分冰片、川芎嗪经ALKBH5/GSK3β/m TOR信号通路抑制过度自噬,减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤。

生脉注射液抗AngⅡ诱导的心肌细胞肥大和凋亡的作用以及对能量代谢的影响

目的研究生脉注射液对Ang Ⅱ诱导的心肌肥厚和细胞凋亡中心肌能量代谢的影响。方法使用0.8μM Ang Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞48 h。将心肌细胞随机分为3组:空白组(Blank),0.8μM Ang Ⅱ打击组(Ang Ⅱ)和Ang Ⅱ 0.8μM+生脉注射液稀释4000倍组(SMI)。通过透射电镜检测线粒体超微结构以评价线粒体功能,通过PCR和Western Blot检测线粒体生物发生相关基因的mRNA和蛋白的表达:AMPK、PGC-1α、CPT-1和GLUT-4。流式细胞仪检测细胞凋亡,PCR检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA的表达。结果 (1)生脉注射液药物可以拮抗Ang Ⅱ的作用,生脉注射液稀释4000倍时拮抗效果最佳。(2)与空白组相比,Ang Ⅱ组心肌细胞活力下降,心肌细胞直径和总蛋白显著增加,线粒体超微结构受损,与能量代谢相关的基因如AMPK、PGC-1α、CPT-1和GLUT-4 mRNA和蛋白的表达下降,心肌细胞凋亡率明显下降,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA的表达(P <0.05)。与Ang Ⅱ组比较,生脉注射液组可明显逆转Ang Ⅱ对心肌细胞的影响(P <0.05)。结论生脉注射液可能通过能量依赖性机制抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大和凋亡。

鹿红方对缺血缺氧心肌细胞SDF-1/CXCR4信号通路的影响

目的研究鹿红方对缺血缺氧心肌细胞(CMs)抗凋亡能力的影响,并从SDF-1/CXCR4信号通路探讨其作用机制。方法CMs分至对照组,缺血缺氧模型组以及鹿红方各剂量组。采用CCK-8法测定CMs凋亡情况以考查鹿红方对CMs抗凋亡能力的影响及量效果关系。后将CMs分至对照组、模型组、AMD3100组、鹿红方200μg/mL组以及鹿红方+AMD3100组。各组予相应干预措施后采用Western blotting检测Bax、Bcl-2、SDF-1和CXCR4蛋白表达。结果CCK-8结果显示,鹿红方提高CMs抗凋亡能力具有量效关系。Western blotting结果显示:鹿红方200组与模型组比较,SDF-1和CXCR4的表达显著升高(P<0.001),Bax表达显著降低,Bcl-2表达显著升高,Bax/Bcl-2值显著降低(P<0.001),鹿红方+AMD3100组与鹿红方200组比较,Bax表达显著升高,Bcl-2表达显著降低,Bax/Bcl-2值显著升高(P<0.001)。结论鹿红方可提高缺血缺氧状态下CMs的抗凋亡能力,其机制与上调SDF-1/CXCR4信号通路有关。

基于mTOR通路探讨中医药调控心肌缺血/再灌注损伤中自噬的研究进展

自噬是广泛存在于真核细胞中用以维持细胞稳态的一种降解途径,在多种心血管疾病尤其是心肌缺血/再灌注损伤的发生、发展中起着重要的调控作用,是治疗心血管疾病的新靶点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路是自噬调控的诸多信号通路中的下游,在心血管疾病自噬过程中起重要作用,可调控心脏自噬,促进自噬流以改善心脏功能。中医药治疗心肌缺血/再灌注损伤的作用机制与自噬密切相关,且具有双向调节自噬的优势。文章拟围绕mTOR通路,对当前可通过调控自噬以保护心肌缺血/再灌注损伤的中药成分及复方研究进展作一综述,以期为未来相关中医药干预自噬研究提供思路。