唐氏综合征胎儿全基因组miRNA表达谱特征及其染色体分布

目的研究唐氏综合征(DS)胎儿全基因组miRNA表达谱及其编码基因的染色体分布特征。方法采用Illumina深度测序技术对6例DS胎儿(DS组)和6例正常胎儿脐带血(对照组)单个核细胞小RNA测序比对分析,确定DS全基因组miRNA表达谱及其编码基因的染色体分布特征。结果两组共检测到395种miRNA,编码于316个miRNA基因。其中149种miRNA在两组中的表达具有显著性差异(DS组中6种上调,143种下调),有51种miRNA特异性表达于对照组。21号染色体编码的14个miRNA基因在DS组中有1个(miR-802)高表达,4个(let-7c、miR-99a、miR-125b和miR-155)低表达,余下9个在两组样本中均未表达。两组样本miRNA基因表达的染色体分布趋于一致,但miRNA基因表达丰度的分布却不尽相同:DS组主要分布于8、16、17和21号染色体,对照组主要分布于3、8、14、16、17和22号染色体。结论 DS胎儿脐带血单个核细胞具有其特定的miRNA表达谱和染色体分布特征,表达丰度差异分布的染色体编码miRNA可能在DS各临床性状的形成过程中具有重要作用。

唐氏综合征胎儿脐带血单个核细胞microRNA差异表达研究

目的检测唐氏综合征(Down syndrome,DS)胎儿和正常胎儿脐带血单个核细胞全基因组microRNA(miRNA)的差异表达。方法运用Solexa高通量测序技术对6例DS胎儿(DS组)和6例正常胎儿(对照组)脐带血单个核细胞miRNA表达水平进行检测,比较分析2组miRNA表达的差异,并用Stem-loop qRT-PCR对Solexa测序结果进行验证。结果 2组样本显著性差异表达miRNA有167种,8种miRNA在DS组样本中表达上调,159种miRNA表达下调;还有38种和139种miRNA分别特异性表达于DS组和对照组样本中;21号染色体上5个miRNA,除miR-802在DS组中高表达外,miR-99a、let-7c、miR-125b和miR-155均低表达。结论 DS胎儿和健康胎儿脐带血单个核细胞miRNA的表达差异显著,可能与DS胎儿免疫系统的发育缺陷及DS胎儿循环T、B淋巴细胞数目的减少有关;差异显著和特异性表达的miRNA可作为DS胎儿潜在的产前筛查诊断指标。

唐氏综合征胎儿21号染色体上新微小RNA基因的鉴定和功能分析

目的:利用Solexa高通量深度测序技术鉴定21号染色体上新的微小RNA(miRNA)基因,为阐明21号染色体功能、探索唐氏综合征(DS)患者新的治疗靶点提供依据。方法:收集5例经染色体核型分析诊断为DS胎儿的脐带血和3例正常胎儿脐带血,分析染色体核型;提取胎儿脐带血单个核细胞总RNA,构建小RNA文库,采用Solexa高通量深度测序、计算机分析、Stem-loop RT-PCR法鉴定miRNA基因并分析其生物学功能。结果:血染色体核型分析,5例DS胎儿脐带血显示DS标准核型,3例正常胎儿脐带血显示正常核型;在DS胎儿脐带血中共发现21个新miRNA,其中仅1个候选miRNA来源于21号染色体,位于21号染色体的"DS关键区域",命名为"miR-nov21",后者在DS胎儿脐带血单个核细胞中表达水平高于正常胎儿。生物学功能分析,miR-nov21可调节211个靶基因共215个位点,与基因的表达、细胞分化的调节、胚胎形态的发生和心脏的发育有关。结论:21号染色体"DS关键区域"存在1个新的miRNA基因———miR-nov21。

6σ质量管理理论在电化学发光法测定肿瘤标志物中的应用

目的探讨六西格玛(6σ)质量管理理论在电化学发光测定肿瘤标志物中的应用。方法根据Westgard等报道的方法计算σ值,分别选用以生物学变异确定的"合适"及"理想"允许总误差(TEa)为质量目标,不精密度(CV%)源于为该室室内质控累积CV%,不准确度(Bias%)源于卫生部临床检验中心肿瘤标志物室间质评结果。结果不同质量目标有不同的σ值及不同的质控方案。结论合理地采用质量目标,结合6σ质量管理理论指导质量控制方案的设计,适合于临床检验质量管理。

强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞中急性时相反应蛋白的差异表达研究

目的检测强直性脊柱炎外周血单个核细胞中急性时相反应蛋白表达水平,探讨其与强直性脊柱炎发病的关系。方法收集10例强直性脊柱炎患者和9例健康对照,提取外周血单个核细胞,采用相对和绝对定量的等量异位标签串联质谱技术检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞中的急性时相反应蛋白表达水平,并运用Western blot方法进行验证差异表达的触珠蛋白(Hp)和铜蓝蛋白(Cp)。结果基于质谱分析的蛋白组学显示,19种急性时相反应蛋白在强直性脊柱炎外周血单个核细胞中蛋白表达水平明显升高(P<0.05),主要包括补体C3、纤粘蛋白(FN1)、血浆酶原(PLG)、转铁蛋白(TF)、Hp和Cp;Western blot检测Hp和Cp的表达水平与相对和绝对定量的等量异位标签串联质谱技术检测结果具有相同的变化趋势。结论急性时相反应蛋白差异表达可能参与了强直性脊柱炎的发生、发展,有望作为强直性脊柱炎的临床生物标记物。

卵巢癌相关抗原CA125串联重复序列的原核表达纯化及抗血清制备

目的:建立CA125串联重复序列(CA125R)原核表达系统,表达纯化重组CA125R蛋白并制备其抗血清。方法:全基因合成一段CA125串联重复序列,并将其克隆至pET-32a(+),构建CA125R蛋白原核表达载体pET-CA125R;将构建好的pET-CA125R载体转化至E.coli BL21(DE3),确定最佳可溶性表达条件,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组CA125R蛋白;纯化重组蛋白经Western blot方法验证后,免疫家兔制备抗血清。结果:成功构建CA125串联重复序列原核表达载体,确定了最佳可溶性诱导表达条件(0.5 mmol/LIPTG,15℃诱导6 h);Western blot结果证实纯化的重组蛋白正确,纯度高;制备的抗血清能特异识别重组CA125R蛋白和天然CA125糖蛋白。结论:成功建立了CA125R高效原核表达系统,并制备了高纯度重组CA125R蛋白及其抗血清。

应用iTRAQ对唐氏综合征胎儿脐带血的蛋白质组学研究

目的筛选并鉴定唐氏综合征胎儿与健康对照者差异性表达蛋白质,以寻找唐氏综合征胎儿的生物标记物。方法应用同位素标记相对和绝对蛋白定量法和功能聚类分析法筛查和分析唐氏综合征胎儿脐带血和正常胎儿脐带血的差异表达蛋白。结果共筛选鉴定到506种差异表达蛋白,其中最显著的3种蛋白分别是基质蛋白-3、胸腺肽β10和骨桥蛋白。结论唐氏综合征胎儿和正常胎儿脐带血血清蛋白存在较多差异表达蛋白,其中基质蛋白-3、胸腺肽β10和骨桥蛋白等显著差异蛋白可能作为潜在的临床筛查生物标志物。

IgA肾病患者全基因组miRNA表达谱的特征及其染色体分布

目的:调查研究IgA肾病(IgA-N)患者全基因组miRNA的表达及其编码基因的染色体分布特征。方法:运用Illumina高通量测序技术分别对6例IgA-N患者肾活检组织和6例肾癌患者癌旁正常组织的全基因组miRNA表达水平进行检测,比较分析两组miRNA的表达差异,并对其编码基因的染色体分布情况进行分析。结果:在两组样本中共检测到370种具有显著性差异表达的miRNA,共同表达的miRNA有249种(在IgA-N组中53种表达上调,196种表达下调),另外还有4种和117种miRNA分别特异性表达于IgA-N组和对照组。两组样本miRNA基因表达的染色体分布趋于一致,染色体1、7、9、14、17和X对疾病的贡献值较高。结论:IgA-N患者肾脏组织具有特定的miRNA表达谱和染色体分布特征。染色体7、17、X可能在IgA1糖基化异常过程中起重要作用。

唐氏综合征患儿外周血全基因组miRNA表达谱及染色体分布研究

目的:分析唐氏综合征(Down syndrome,DS)患儿与健康儿童外周血单个核细胞miRNA表达谱及其染色体分布特征。方法:采用Illumina测序技术分别对6例DS患儿(DS组)和6例健康儿童(对照组)外周血单个核细胞全基因组miRNA表达谱进行差异表达和染色体分布特征分析,并用Stem-loop q RT-PCR对差异表达miRNA的测序结果进行验证。结果:两样本共表达911个miRNA,编码于738个miRNA基因,在两样本中的染色体分布趋于一致,但表达丰度染色体分布却不同,DS组主要分布于7、13和21号染色体,而对照组主要分布于7和13号染色体。此外,911个miRNA中有114个miRNA在两样本中差异表达显著(差异倍数≥2且P≤0.001),其中DS组有103种高表达,包括21号染色体编码的5个miRNA(miR-99a、let-7c、miR-125b、miR-155和miR-802);11种低表达。结论:DS患儿外周血单个核细胞具有其特定的miRNA表达谱和染色体分布特征,两样本表达丰度差异分布染色体编码miRNA的差异表达可能与DS患者免疫缺陷等相关临床症状的形成有关。

唐氏综合征患儿外周血全基因组miRNA差异表达及生物学功能分析

目的检测唐氏综合征(DS)患儿与健康儿童外周血单个核细胞miRNA表达的差异,探索DS患儿21号3染色体扰乱2倍体基因表达和免疫缺陷的形成机制。方法收集6例标准核型DS患儿(DS组)和6例健康儿童(non-DS组)外周血标本,分别提取各组样本外周血单个核细胞总RNA等量混合,构建DS组和non-DS组small RNA文库,采用Illumina测序技术对两组样本外周血单个核细胞miRNA的表达水平进行差异分析,同时对差异表达miRNA调控靶基因进行生物信息学功能分析,并用Stem-loop qRT-PCR对Illumina测序结果和差异表达miRNA的调控靶基因进行验证。结果两样本总共表达miRNA有911种,其中只有114种miRNA显著性差异表达(差异倍数>2,P<0.001),其中有11种在DS组中低表达,103种高表达,包括编码于21号染色体的5个miRNA(miR-99a、let-7c、miR-125b、miR-155、miR-802)。生物学功能分析显示高丰度差异表达miRNA调控靶基因与造血和淋巴器官的发育、胸腺的发育、T/B细胞的分化和活化有关。结论 DS患儿21号3染色体对2倍体miRNA表达丰度的影响较小,21号染色体编码miRNA也未均呈现1.5倍以上的升高,高丰度差异表达的miRNA可能与DS患儿免疫系统的发育缺陷以及DS患儿循环T、B淋巴数量的异常有关。

外阴鳞状细胞癌患者癌组织VEGF、Bcl-2基因启动子的DNA甲基化及其表达

目的通过检测外阴鳞状细胞癌(VSCC)患者癌组织血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Bcl-2基因启动子的DNA甲基化及其表达,探讨VSCC的发病机制。方法采用DNA甲基化免疫沉淀—实时定量聚合酶链反应技术,对8例VSCC患者癌组织和毗邻正常组织的VEGF、Bcl-2基因启动子DNA甲基化进行定量分析;用定量反转录聚合酶链反应检测其基因表达。结果 VSCC患者的癌组织VEGF、Bcl-2基因启动子呈低甲基化,其甲基化与正常组织比较有统计学差异(P<0.05);低甲基化VEGF、Bcl-2 mRNA表达增加。结论 VSCC患者的癌组织VEGF、Bcl-2基因启动子存在低甲基化,低甲基化可促其mRNA表达。表明VEGF、Bcl-2基因低甲基化可能参与VSCC发生,成为其新的表观治疗靶点。

TFPI-2对人肝癌细胞生长增殖、凋亡及AFP合成的影响

目的:探讨TFPI-2基因对人肝癌细胞Hep3B生长增殖、凋亡及甲胎蛋白AFP表达的影响。方法:将重组质粒PCDNA3.1-TFPI-2转染Hep3B细胞并经G418稳定筛选后,RT-PCR和Westernblot检测转染前后TFPI-2 mRNA和蛋白表达水平,采用CCK-8法、生长曲线观察TFPI-2对人肝癌细胞Hep3B生长增殖的影响,通过平板克隆形成实验观察单个细胞的增殖能力,RT-PCR检测AFP mRNA的表达,并用电化学发光法测定培养上清液中甲胎蛋白AFP含量,流式细胞仪检测细胞早晚期凋亡情况。结果:转染成功的Hep3B细胞检测到TFPI-2 mRNA和蛋白的表达;与转染空载体及未转染的细胞相比,转染TFPI-2的细胞生长增殖能力明显减弱;AFP mRNA表达抑制率为16.51%,AFP蛋白分泌明显低于对照组(P<0.01);流式细胞术检测转染TFPI-2的Hep3B细胞早期凋亡率明显增加(24.03%±7.28%vs 8.77%±3.66%)。结论:TFPI-2表达可显著抑制肝癌细胞生长和AFP的表达,同时还能诱导细胞早期凋亡。为进一步探讨靶向TFPI-2的肝癌基因治疗提供了实验依据。

强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞微小RNA的差异表达

目的探讨强直性脊柱炎患者和健康对照组外周血单个核细胞已知微小RNA（miRNA）差异表达。方法分别构建10例强直性脊柱炎患者和9例健康对照组外周血单个核细胞小RNA文库，并运用新一代高通量Solexa测序技术，进行外周血单个核细胞已知miRNA的检测；运用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）进一步验证部分差异miRNA表达。结果在强直性脊柱炎患者与对照组中小RNA文库中，共获得小RNA总量分别是7511859和10178958，比对上基因组部分小RNA分别是6052911（80．58％）和8476243（83．27％）；已知miRNA分别是267和231个，通过miRNA差异性分析，129个上调miRNA和28个下调miRNA，其表达水平差异有统计学意义（P〈0．05）；FQ—PCR进一步验证了let-7b-3p、miR-146a-5p、miR-155—5p、let-7g-5p和miR-323a-5p差异表达水平与Solexa测序结果相似趋势。结论强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞miRNA的差异表达，可能与强直性脊柱炎发病密切相关。

病理程度不同IgA肾病患者血清代谢的差异性研究

目的寻找诊断IgA肾病潜在的生物标志物,并探讨其代谢途径。方法原发性IgA肾病患者35例(IgA肾病组),其中低危组23例,高危组12例,同期体检健康者23名为对照组,采用基于质谱核磁共振代谢组技术结合模式识别分析各组血清代谢物的差异。结果对照组与IgA肾病组血清代谢物比较差异有统计学意义(P<0.05);低危组和高危组血清代谢物比较差异无统计学意义(P>0.05);共筛选出24种IgA肾病的特征代谢物。结论应用质谱核磁共振代谢组技术成功建立了IgA肾病血清代谢诊断模型。

组织因子途径抑制物-2对人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长及血管生成的影响

目的:探讨组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)对人肝癌Hep3B细胞株裸鼠皮下移植瘤生长以及肿瘤血管生成的作用。方法:将TFPI-2稳定表达的Hep3B细胞(Hep3B-TFPI-2组)、转染空载体PCDNA3.1的Hep3B细胞(Hep3B-V组)及未进行转染的Hep3B细胞(Hep3B-P组)分别接种于裸鼠皮下,待皮下成瘤后,每隔3d测量1次肿瘤大小,并绘制出肿瘤体内生长曲线。3周后处死裸鼠,测定肿瘤体积,提取组织中总RNA和蛋白,实时荧光定量PCR(real-time uorescence quantitative PCR,RFQ-PCR)检测肿瘤组织中TFPI-2和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA水平;蛋白质印迹法检测肿瘤组织中TFPI-2和VEGF蛋白表达水平;免疫组织化学法检测肿瘤组织中TFPI-2蛋白表达水平和肿瘤微血管密度(micro vessel density,MVD)。结果:Hep3B-TFPI-2组最终肿瘤体积明显小于Hep3B-V组和Hep3B-P组(P<0.05)。Hep3B-TFPI-2组肿瘤组织的TFPI-2mRNA表达丰度和蛋白水平明显高于其余2组(P<0.05);而Hep3B-TFPI-2组VEGFmRNA表达丰度和蛋白水平明显低于其余2组,与2个对照组相比,VEGF蛋白表达抑制率分别为19.8%和23.5%(P<0.05)。Hep3B-TFPI-2组MVD计数明显低于其余2组(P<0.05)。结论:TFPI-2能抑制人肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长和肿瘤血管生成。

环氧化酶-2基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签的环氧化酶-2(cyclooxyge-nase-2,COX-2)基因shRNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。方法将前期构建的真核表达质粒pGenesil-1-COX-2-shRNA及阴性对照质粒pGenesil-1-HK的表达启动子U6及shRNA序列亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP,酶切及测序鉴定正确后,经PmeⅠ线性化,转化感受态AdEasier,构建重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP,经PacⅠ线性化,转染AD293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP,经3轮扩增后,测定滴度。RT-PCR和Western blot法检测感染细胞中COX-2基因mRNA的转录及蛋白的表达,MTS法观察重组腺病毒对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP及重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP经酶切和测序鉴定均构建正确,并成功转染AD293细胞,经包装和3轮扩增后,重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP的滴度分别为1.4×1012和2.0×1012pfu/ml。重组腺病毒感染的SMMC-7721细胞中COX-2基因mRNA、蛋白相对表达量及细胞增殖能力均明显低于空白对照组及阴性对照组(P均<0.05)。结论成功构建了COX-2基因shRNA重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP,且可显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,为进一步研究COX-2作为肝癌基因治疗靶点及机制奠定了基础。

卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备

目的制备卵巢癌相关抗原CA125R单克隆抗体,并进行鉴定。方法将CA125一段串联重复序列(CA125R)基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-CA125R,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-CA125R融合蛋白。表达的融合蛋白经GST亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备CA125单克隆抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性,单克隆抗体亚类测定试剂盒分析单抗的亚类。腹水诱生法大量制备单抗,SDS-PAGE分析单抗的纯度,间接ELISA法检测单抗的效价。结果重组原核表达质粒pGEX-CA125R经双酶切及测序,证实构建正确;纯化的GST-CA125R融合蛋白相对分子质量约44 000,纯度约为95%,可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性反应;获得1株可稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-B2,其分泌的单抗能特异识别GST-CA125R融合蛋白和天然CA125糖蛋白,其抗体亚型为IgG2a型;纯化的腹水单抗纯度约为90%,效价达1×106以上。结论成功获得1株能特异性识别天然CA125糖蛋白的单克隆抗体细胞株,并经腹水诱生法大量制备了抗体,为CA125临床检测试剂盒的研发奠定了基础。

IgA肾病患者肾脏组织中差异表达microRNAs的筛选

目的了解IgA肾病患者肾脏组织全基因组miRNA的表达特征及其作用。方法分别收集6例IgA肾病患者肾穿组织和6例镜下病理检查正常的肾皮质组织,运用Illumina高通量测序技术分别对其miRNA表达水平进行检测,比较分析两组miRNA的表达差异,并运用生物信息学技术对其功能进行初步分析。结果在两组样本中具有显著性差异表达的miRNA有168种,其中在IgA肾病组中表达上调的有33种,表达下调的有135种;另外还有30种miRNA在对照组中特异性表达。结论 IgA肾病患者与对照组样本的组织miRNA表达有显著性差异。miR-148b、miR-152可能与IgA1分子糖基化缺陷有关,而miR-200家族、miR-23b、miR-126和miR-192等可能在肾脏病理改变中起重要作用。

唐氏综合征胎儿脐带血与外周血microRNA差异表达研究

目的检测唐氏综合征(Down syndrome,DS)脐带血与外周血单个核细胞中micro RNA差异表达图谱,进行比较分析。方法 Illumina检测脐带血与外周血中micro RNA的表达水平,比较两组间的差异表达,并进行靶基因预测与基因功能注释。结果脐带血与外周血显著差异表达的micro RNA分别有344和253种,分析可知,外周血表达上调的mi RNA增加了179种,下调的减少了270种。GO分析有5个生物学过程在预测的靶基因中被有意义的富集(P<0.001)。结论 DS脐带血与外周血micro RNA的表达差异显著,可能与胎儿生长发育过程中免疫系统缺陷,智力低下等症状的发生,发展相关。