大叶落地生根KdSRG1基因的克隆、表达分析及自激活检测

为探究大叶落地生根(Kalanchoe daigremontiana)中衰老相关基因1(Senescence-related gene 1,SRG1)的功能,以野生型大叶落地生根为材料,克隆KdSRG1基因,对其进行生物信息学分析、亚细胞定位和基因表达分析。结果表明:KdSRG1基因开放阅读框为219 bp,编码72个氨基酸;KdSRG1蛋白是一个亲水性的不稳定酸性蛋白,定位于细胞核和细胞质,不含跨膜结构和信号肽,并且具有物种上的特异性;该基因在大叶落地生根的不定芽和叶中的相对表达量较高,说明其参与不定芽和叶的生长调控;通过分析其启动子顺式作用元件,推测KdSRG1基因参与植物分生组织表达和栅栏细胞分化过程,并且其表达可能受光信号、脱落酸(Abscisic acid,ABA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)调控,同时可能在植物逆境胁迫调控方面发挥作用;自激活检测表明KdSRG1蛋白没有自激活活性,可用于后续的酵母双杂实验。本研究为进一步研究KdSRG1基因的作用机制及功能奠定了基础。

蒺藜苜蓿MtCKX基因功能的初步鉴定

采用RT-PCR法克隆了蒺藜苜蓿MtCKX基因,基因编码区长1635bp,编码544个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码的蛋白与其他物种CKX蛋白具有较高的同源性,与鹰嘴豆的同源性最高。荧光定量分析结果表明,MtCKX基因在蒺藜苜蓿叶片中的表达量最高。此外,MtCKX基因还响应IAA、6-BA的诱导。成功构建了35S::MtCKX:YFP植物表达载体,亚细胞定位分析表明,MtCKX定位于细胞膜和细胞核。过表达的蒺藜苜蓿MtCKX基因可导致转基因拟南芥中细胞分裂素含量显著降低。

日本结缕草ZjNOL基因的克隆及转录自激活检测

NYC1-like(NOL)编码的短链氧化还原酶是叶绿素b降解的必需酶。对日本结缕草(Zoysia japonica)ZjNOL基因全长克隆结果显示,该基因开放阅读框为981个核苷酸,编码327个氨基酸。生物学分析显示,ZjNOL蛋白与高粱(Sorghum bicolor)中的NOL蛋白的亲缘关系最近。利用pGBKT7载体,通过DNA重组技术成功构建pGBKT7-ZjNOL酵母表达载体,通过PEG介导的转化方法,成功导入Y2HGold酵母中,自激活检测显示含有pGBKT7-ZjNOL的Y2HGold酵母细胞能够在SD/-Trp培养基上正常生长,而在SD/-Trp/AbA培养基上不能生长,也不能在含有X-α-Gal培养基显蓝色,证明ZjNOL蛋白没有自激活活性。生物信息学分析及转录自激活检测有助于深入研究ZjNOL基因功能,为延长结缕草绿期,改善结缕草坪用质量奠定基础。

砷胁迫下老芒麦和香根草根茎叶砷吸收特征及抗氧化响应

采用盆栽试验,研究3种砷浓度下(0、10和100 mg·kg-1)老芒麦(Elymus sibiricus)和香根草(Vetiveria zizanioides)生长特征及根、茎、叶三部位砷含量变化及其细胞膜透性、抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)]响应特征。结果表明,低浓度砷对老芒麦和香根草株高和生物量抑制不明显,高浓度下抑制显著(P<0.05),二者相比香根草对重金属砷有更好的抗性。除老芒麦叶片变化不显著外,两种植物其余部位的砷含量均随着浓度的增加而显著增加;老芒麦地上部的砷积累量随浓度的增加显著降低,香根草则表现出随浓度的增加显著升高,高浓度条件下香根草地上部的砷积累量要高于老芒麦。老芒麦根、茎、叶三部位的细胞膜透性均表现出随砷浓度增加显著升高,香根草根、叶部位表现出相同的变化趋势,但茎部的差异不显著(P>0.05)。砷胁迫引起了老芒麦根、茎、叶三部位CAT、SOD和APX活性的显著增加,而香根草这3种酶的活性能够在10和100 mg·kg-1间维持。POD活性有所不同,表现为砷胁迫引起两种植物茎、叶部位降低,根系增加。综合而言,香根草对于重金属砷有更好的抗性、更强的富集能力,并且SOD与POD可能在其抗氧化体系中起关键作用。

蒺藜苜蓿MtSAG113基因的转化及表达特征分析

Senescence Associated Gene 113(SAG113)基因属于PP2Cc超家族,该基因的研究主要集中在植物衰老领域。为分析蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)MtSAG113基因的表达特征,探究MtSAG113基因的功能。该基因从蒺藜苜蓿中克隆得到,以烟草(Nicotiana tabacum L.)和蒺藜苜蓿R108为实验材料,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草获得具有抗性的转基因植株,并对逆境胁迫和外源激素诱导下蒺藜苜蓿MtSAG113基因的表达情况进行检测。结果显示:PCR检测成功获得5株转基因植株并在在烟草中成功表达,且转基因植株相比于野生型出现矮小和叶片早衰的表型;MtSAG113基因在衰老叶片中表达水平远远高于未衰老叶片;未处理的叶片中,该基因的表达水平随着时间的延长逐渐提高;干旱胁迫下,该基因表达水平随着时间推移显著提高;高盐胁迫下,该基因表达水平明显上调,在12 h达到峰值;该基因对6-BA诱导尤为敏感,表达水平随着时间推移显著提高,在4 h达到峰值,约为未处理的1 000倍;而在ABA和IAA诱导条件下,MtSAG113呈现类似的表达特征,从4 h开始提高,12 h达到峰值;亚细胞定位结果显示,该基因位于细胞核内。以上结果表明:MtSAG113基因可能在蒺藜苜蓿衰老调控上发挥着一定的作用;而高盐、干旱和外源激素对MtSAG113基因表达具有一定的调节作用,以上研究为进一步分析MtSAG113基因的功能提供基础。

蒺藜苜蓿转录因子MtMYB的克隆、表达分析及拟南芥转化

MYB转录因子家族基因具有保守的DNA结合域,是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的代谢调控,在植物生长发育和胁迫响应等方面发挥重要作用。为改良品种性状和提高生产实践能力,本研究采用RT-PCR法克隆蒺藜苜蓿MYB转录因子基因MtMYB,其编码区长255 bp,编码84个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白与其他物种MYB蛋白具有很高的同源性,其中与红三叶同源性最高。荧光定量结果表明,MtMYB基因在蒺藜苜蓿叶片中的表达量最高。MtMYB基因在外源IAA、6-BA的诱导下,总体都呈现先上升后下降的趋势。同时本研究成功构建35S::MtMYB的植物表达载体,并通过转基因技术将其转化至拟南芥中,PCR检测表明,MtMYB已成功整合至转基因拟南芥基因组中。RT-PCR检测表明,MtMYB能够在转基因拟南芥中正常转录。本研究为进一步探明MtMYB基因的功能提供了数据参考和实验材料。

蒺藜苜蓿B561基因的克隆及对拟南芥的转化

细胞色素B561是一种负责电子传递的整膜蛋白,在植物生长发育、抗毒素防御反应方面具有重要作用,并且能够防止植物在干旱条件下由于过度光照而受损。本研究以蒺藜苜蓿为试验材料,采用RACE技术获得蒺藜苜蓿B561基因全长,其编码区长807 bp,编码269个氨基酸。生物信息学分析显示:该基因编码蛋白与其他物种B561蛋白具有较高的同源性,与大豆的同源性最高。利用DNA重组技术将B561基因完整编码区连接至基因表达载体pBI121,成功构建植物表达载体pBI-B561,并通过农杆菌介导法转将其转化至拟南芥,成功获得25株转基因植株。本研究为进一步探究B561基因的功能提供了数据参考和试验材料。

蒺藜苜蓿酵母杂交cDNA文库的构建与分析

酵母双杂交和单杂交技术是筛选蛋白质互作或蛋白质与DNA互作的一种高效分子生物学技术,是生物大分子互作和调控的重要的手段。为了获得高容量的蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)基因文库,为后续深入挖掘蒺藜苜蓿相关基因,改善蒺藜苜蓿品质提供基础。本研究选取了不同组织来源的蒺藜苜蓿,并对蒺藜苜蓿进行不同的激素诱导或胁迫处理,利用SMART技术成功构建高容量的蒺藜苜蓿酵母杂交cDNA文库。文库质量检测结果表明:文库滴定数为5×10^(7)CFU/m L,文库库容量为1.28×10^(7)CFU,平均插入片段长度大于1000 bp,24个克隆全部能够扩增出条带,c DNA片段重组率为100%。该文库质量较高,所包含的遗传信息完整,符合酵母杂交筛选试验要求,可应用于蒺藜苜蓿基因表达调控的研究和互作蛋白的筛选试验。

蒺藜苜蓿MtGT1基因克隆、表达及亚细胞定位分析

目前,尚未见关于模式植物蒺藜苜蓿Trihelix转录因子家族成员的功能性研究,本研究在蒺藜苜蓿中发现一个Trihelix转录因子家族的成员MtGT1基因。为了初步鉴定该基因的功能,本研究以蒺藜苜蓿为试验材料,根据MtGT1基因序列设计引物,通过基因克隆、生物信息学分析、荧光定量等手段,从蒺藜苜蓿中分离MtGT1基因。生物信息学技术分析结果显示,该基因属于Trihelix家族的GT1亚家族,与三叶草的同源性较高,可能为脂溶性疏水蛋白,不含有跨膜结构和信号肽;二级结构显示其由α螺旋、延伸链和无规则卷曲3种结构组成;三级结构发现其部分残基与拟南芥GT1的DNA结合结构域相似度极高。荧光定量表达发现,该基因在根中表达量最高,且响应IAA和6-BA两种植物激素及干旱、低温等非生物胁迫;亚细胞定位发现该蛋白是核定位蛋白。该研究可为深入挖掘MtGT1基因的功能提供理论依据。

紫花苜蓿MsNAP启动子克隆及转基因分析

启动子位于基因上游,起着调控基因转录的作用,是研究基因表达特征和功能的重要元件。为了研究MsNAP启动子活性,探究MsNAP基因功能,进而研究高产优质的紫花苜蓿,造福畜牧业,本试验利用染色体步移法,成功获得了紫花苜蓿MsNAP基因翻译起始位点上游1 390 bp序列,通过生物信息学分析,发现该区域存在一个完整的启动子,含有多种顺式作用元件。利用DNA重组技术,成功构建了MsNAP启动子表达载体,通过农杆菌介导技术成功转入到烟草中。选取衰老与未衰老的烟草叶片,进行葡萄糖苷酸酶(glucuronidase, GUS)染色分析,结果显示,在衰老叶片中GUS活性远远高于未衰老叶片,表明MsNAP启动子在衰老的叶片中具有较高的转录调控活性,从而为深入研究MsNAP启动子活性和分析MsNAP基因的功能提供了基础。