鸡白痢和肠炎沙门氏菌抑制差减文库的构建与分析

应用抑制差减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门氏菌C79-13与肠炎沙门氏菌50041进行基因组片段的差异分析,构建鸡白痢沙门氏菌的差减文库。经Dot-blot筛选,并对部分片段进行测序和同源性分析。结果表明:这些序列主要分为3类,即型分泌系统相关序列、质粒转移相关序列、未知功能序列。其中2个差减片段与编码福氏志贺菌侵入质粒抗原IpaJ蛋白基因的同源性达50%。证明所构建的差减文库可为鸡白痢沙门氏菌特异性致病基因和其致病机理的研究提供重要的依据。

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。

部分省市鸡白痢和鸡伤寒的单抗阻断ELISA血清学调查

采用单抗阻断ELISA法对我国部分省市不同品种、不同类型的鸡群进行了鸡白痢、鸡伤寒的血清流行病学调查。结果,在2309份鸡血清样品中检出阳性359份,阳性率为15.5%,不同鸡场鸡群感染率悬殊较大,从0到54.5%不等。表明,我国鸡群中鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌的流行呈现多样化。

鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析

采用抑制性消减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析。结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段。经同源分析,这些序列可分为3类:噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列。这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素I、paJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因。结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株基因组间存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础。

大力提升生物工程专业实践能力的做法和思考

生物工程是以生物学的理论和技术为基础,并结合化工、机械、电子计算机等学科的新兴综合性应用学科和工程技术领域。如何培养学生的实践能力是生物工程专业人才培养中的关键点,应该结合生物工程专业的实践教学,从专业基础实验、专业综合实验、"3+1"卓越人才培养模式和全程实践教学理念等方面进行人才培养的改革与探索。

鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌基因组消减文库的构建

为了解鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的基因组差别,筛选鸡白痢沙门氏菌特有的序列,利用SSH对鸡白痢沙门氏菌C79-13(实验方)与鸡伤寒沙门氏菌Sg9(驱动方)基因组进行了比较。选择四碱基内切酶Rsa I将C79-13与Sg9基因组DNA酶切,酶切的C79-13基因组DNA分成两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR,得到消减混合物,将其与PCR 2.1克隆载体连接,转化感受态E.coli DH5α建立消减文库。结果共获得400个阳性克隆;筛选240个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2000 bp大小的片段。差异DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆鸡白痢沙门氏菌特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。

优化整合生物工程专业课程实验 建立综合大实验课程体系

以强化培养生物工程专业学生的工程能力和创新能力为目标,以国家生物医药产业政策为背景,研究提出优化整合我校生物工程专业课程实验体系,建立综合大实验课程以适应当前社会发展的生物工程专业卓越工程师培养,形成科学的生物工程专业课程实验体系,并加以实施,培养出具有扎实工学科学基础和生物工程专业技术能力基础,较强生物工程开发、设计与实践能力,知识更新与自我完善能力、良好沟通与组织管理能力和国际视野的生物工程专业优秀人才。

病原细菌组学的研究进展

文章探讨了病原细菌组学在病原微生物基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学方面的研究进展,对病原细菌组学的应用前景进行了展望。

沙门菌CRISPR的结构与功能研究进展

近年发现沙门菌中恒定地存在两个CRISPR位点,沙门菌利用它们不仅能抵御外源质粒和噬菌体的入侵,还能介导自身短期的表型变化及长期亚类的进化。同时由于其结构的多样性,使之广泛应用于沙门菌分型和进化的研究。论文简要综述了沙门菌CRISPR系统的基本结构、作用机制和功能及其在沙门菌分型和进化应用方面的研究进展。

CRISPR结构及作用机理研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeat,CRISPR)为原核生物构建了一种抵御外源DNA侵扰的防御机制,近年来成为国内外细菌研究者们的研究热点。在介绍CRISPR系统的研究历史、分布分类、结构特征的基础上,对其作用机制以及应用前景方面进行了综述。

利用SCOTS技术筛选鸡白痢沙门菌感染巨噬细胞的转录序列

沙门菌在巨噬细胞内的存活是其在宿主内长期定植的主要因素之一,研究利用选择性捕获转录技术(SCOTS)筛选鸡白痢沙门菌S06004株在感染鸡巨噬细胞系HD-11过程中细菌表达的基因。结果显示:鸡白痢沙门菌以MOI值为100∶1感染HD-11细胞1 h后,感染率达11.75%;选取感染1 h时间点作为研究对象,利用SCOTS技术获得了12个鸡白痢沙门菌的转录序列,包括与沙门菌感染相关的毒力基因调控因子inv F;构建了inv F、teh B和tol C基因插入突变株。突变株侵入HD-11的能力明显低于野生株,反映了SCOTS筛选获得的基因在鸡白痢沙门菌感染巨噬细胞时发挥重要的作用,为深入揭示鸡白痢沙门菌的感染机制提供了基础。

微生物组与动物疫病防控

微生物组研究的发展推动了人类不断探索人体微生物群与疾病之间的相关性。然而,微生物组学在动物疫病防控中的研究尚处于起步阶段。本文对动物疫病防控领域中微生物组研究所发挥的6个作用进行了阐述:揭示疾病与菌群的相关性,鉴定新发病原体,确立有益于维持机体健康生长的菌群,筛选疾病防控的新药物和新制剂,开发新疫苗或改进疫苗的使用效果,提出更简单有效的防控措施。

结核分枝杆菌RpfE蛋白的原核表达及鉴定

以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增复活促进因子E(rpfE)基因,并将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,重组表达质粒pET32a-rpfE转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示目的蛋白在细菌裂解上清和沉淀中均有表达,进一步对可溶表达的蛋白通过镍柱亲和纯化,获得高纯度的重组蛋白。Western-blotting试验结果表明:重组RpfE蛋白能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。这为探索RpfE蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制等奠定基础。

沙门菌减毒疫苗候选基因的研究进展

减毒沙门菌活疫苗比灭活疫苗和亚单位疫苗优越,不仅能诱导强烈的体液免疫反应、黏膜免疫反应和细胞免疫反应,还可用作疫苗载体。利用现代基因工程技术构建减毒沙门菌活疫苗需要平衡减毒沙门菌毒力及其免疫原性,因此其候选基因的选择至关重要。文章概括地阐述了沙门菌减毒疫苗候选基因的研究进展,为将来新疫苗的研究提供参考。

猪霍乱沙门菌疫苗株C500毒力致弱的主要原因是rpoS基因的缺失（英文）

目的猪霍乱沙门菌疫苗株C500在我国应用于仔猪副伤寒的防控已长达50多年,然而由于C500是通过化学诱变法获得,因此其遗传背景仍不清楚。本文从基因组水平揭示C500疫苗株毒力致弱的主要原因。方法利用MOH-SSH方法比较了强毒株C78-2与C500之间的基因组差异,结合荧光定量PCR与动物实验检测缺失基因对疫苗株毒力的影响。结果发现C500缺失了6个基因(asr、ydgF、ydgD、ydgE、rpoS和ptsG)。其中,作为调控基因的rpoS在沙门菌致病过程中发挥着重要的作用。荧光定量PCR检测发现rpoS调控的基因在C500中的表达出现不同程度的下调。此外,动物实验结果显示rpoS缺失的C78-2突变株C78-2ΔrpoS毒力下降了100 000倍。结论 rpoS基因的缺失是导致C500致弱的主要因素。

肠炎沙门菌BigA蛋白自转运区段的原核表达与鉴定

为了从肠炎沙门菌C50041中克隆Big A蛋白自转运区段编码序列(big A-C),并原核表达该区段蛋白进行免疫原性分析,利用生物信息学手段初步预测Big A蛋白结构与功能信息,以PCR扩增big A-C序列,采用原核表达载体p ET30b(+),在大肠杆菌中表达肠炎沙门菌C50041的Big A蛋白自转运区段(Big A-C),经动物免疫和ELISA鉴定表达蛋白的免疫原性。结果显示,从肠炎沙门菌中克隆的大小为750 bp的big A-C序列,其原核融合表达产物His-Big A-C大小为35 ku。以蛋白免疫小鼠获得的抗血清可与肠炎沙门菌全菌抗原反应,证实big A-C序列编码的Big A-C具有免疫原性,预示其在肠炎沙门菌感染过程中发挥重要作用。

鸡白痢沙门菌中三型分泌系统-2效应蛋白基因分布研究

为了解鸡白痢沙门菌中三型分泌系统-2（T3SS2）效应蛋白基因的分布情况。本研究采用PCR方法检测了在1962~2013年间从我国分离的237株鸡白痢沙门菌中25个T3SS2效应蛋白基因的分布特征;同时,通过序列比对分析了这25个基因在18株不同血清型沙门菌中的流行特征,它们的全基因组序列来自GenBank。PCR结果显示,在这237株菌株中,cigR、pipB、pipB2、slrP、sopD、sopD2、spiC、sseF、sseG、sseJ、sseK1、sseL、steA、steB、steC和steD均存在,gogB和sspH1均缺失,其它基因分布水平在5.9%~99.6%之间。序列比对分析结果显示,有15个基因在这18株菌株中均存在,sifB、sseK1、sspH2和steC在一些菌株中是假基因。结果表明,gtgE、sseI和sseK2在这237株菌株中分布具有一定的年代规律性;大部分被检测基因在鸡白痢沙门菌中具有广泛分布;一些基因在微进化过程中形成了假基因。

肠炎沙门菌C50041减毒疫苗候选株的构建与筛选

肠炎沙门菌是重要的食源性人兽共患病原菌,该菌主要感染禽类,并通过污染的禽制品感染人类,引起人的胃肠炎。为开发用于养禽业防控该病的疫苗,以肠炎沙门菌感染鸡模型中体内表达的抗原基因为靶标,研制减毒疫苗候选株。利用λ-Red同源重组系统构建肠炎沙门菌C50041体内表达抗原编码基因SEN0039、SEN1650、SEN2573及SEN2804的单缺失株,并对野生株和缺失株的生物学特性及对雏鸡致死率的差异进行比较分析。结果表明:4株基因缺失株的生长特性和生化特征未发生显著改变,且表现出良好的遗传稳定性。动物试验结果表明缺失株C50041ΔSEN0039对3日龄SPF雏鸡的LD50与野生株相比,升高近80倍,具有开发成鸡肠炎沙门菌减毒疫苗的潜力。这一研究为进一步研制禽副伤寒的减毒疫苗奠定了基础。

鸡白痢沙门菌ipaJ基因的克隆与鉴定

【目的】从鸡白痢沙门菌C79-13中克隆ipaJ基因,体外表达该蛋白后进行免疫原性分析。【方法】鸡白痢沙门菌C79-13与肠炎沙门菌50041进行抑制差减杂交后获得的片段PEA2、PE31和PE44与猪霍乱沙门菌C500疫苗株pSFD10质粒上ipaJ基因高度同源,拼接后获得了鸡白痢沙门菌完整的ipaJ基因序列。从鸡白痢沙门菌中克隆出ipaJ基因并将其构建到原核表达载体pET-30a(+)上,Western-blot检测体外表达蛋白的免疫原性,同时检测了该基因在鸡白痢沙门菌分离株中的分布。【结果】从鸡白痢沙门菌中克隆了大小为840bp的ipaJ基因序列,并获得了体外原核表达的大小为37kDa融合蛋白。该蛋白可与鸡白痢沙门菌阳性血清反应。PCR结果显示该基因广泛存在于鸡白痢沙门菌菌株中。【结论】本文首次报道和克隆了鸡白痢沙门菌ipaJ基因,并证明了IpaJ蛋白具有免疫原性。

空肠弯曲菌NCTC11168基因组表达文库的构建及鉴定

将空肠弯曲菌NCTC11168基因组用Sau3AⅠ部分酶切,回收400～3 000bp的片段。用BamHⅠ酶切原核表达载体pET30a(b,c),用SAP去磷酸化后,切胶回收线性载体片段。将基因组片段与载体按摩尔比例10∶1连接,转化DH5α感受态细胞,PCR分析插入片段大小的分布和插入的正确率。从转化的平板上提取质粒,转化表达宿主菌BL21(DE3),获得基因组表达文库。用IPTG诱导BL21(DE3),SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。提取基因组,以0.5U/μg Sau3AⅠ于37℃部分酶切基因组,回收400～3 000bp片段。载体用2.5U/μg BamHⅠ线性化后,用0.8U/μg SAP将其完全去磷酸化。基因组片段与载体连接转化DH5α感受态细胞,获得了基因组表达文库,库容达52 700个克隆,可以覆盖弯曲菌全基因组4次以上,片段插入正确率为83.3%～91.7%,片段大小为400～3 000bp,且均匀分布,IPTG诱导表达文库后蛋白呈现高效表达,表明成功构建了空肠弯曲菌的基因组表达文库。