基于介孔硅的姜黄素⁃siRNA共递送系统构建及其对巨噬细胞M2型极化的影响

目的构建以介孔硅为基础的姜黄素(curcumin,CUR)⁃siRNA共递送系统,探讨其对巨噬细胞向M2型极化的促进作用。方法采用常规溶胶⁃凝胶法制备介孔硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles,MSN),在其内部孔道吸附小分子CUR,外层吸附阳离子高分子聚乙烯亚胺(polymeric polyethyleneimine,PEI),与带负电的siRNA结合,形成(CUR@MSN)PEI/siRNA纳米共递送系统;采用透射电镜观察纳米粒制备过程;以不同浓度的纳米粒处理巨噬细胞RAW264.7,采用MTT方法检测细胞活力变化;采用FAM荧光标记的siRNA制备纳米粒后转染细胞,分别采用激光共聚焦扫描显微镜和透射电镜观察纳米粒的细胞摄取;采用靶向GAPDH的siRNA制备纳米粒后转染RAW264.7细胞,观察对靶基因的沉默效率,对照组为未处理细胞组、仅递送CUR组、CUR与siRNA阴性对照(siNC)共递送组,采用实时定量PCR检测沉默效率;进一步采用miRNA⁃130a⁃3p反义序列(antisense oligonucleotide,ASO)制备纳米粒转染巨噬细胞RAW264.7,观察对巨噬细胞极化的影响,对照组为未处理细胞组、仅递送CUR组、CUR与miRNA阴性对照(miNC)共递送组,采用Western Blot检测巨噬细胞M2极化标志物精氨酸酶1(arginase 1,Arg⁃1)的表达。结果(CUR@MSN)PEI/siRNA纳米共递送系统可成功构建;纳米粒呈现剂量依赖性的细胞毒性,在10μg/mL以下浓度处理组细胞活力在90%以上;纳米粒可被细胞高效摄取,显著抑制靶基因GAPDH的表达,效率约80%(P<0.05 vs.其余各组);仅递送CUR或CUR与miNC共递送组细胞Arg⁃1的表达提升约3倍(P<0.05 vs.未处理细胞组),在共递送CUR和ASO后能发挥二者的协同作用,促进巨噬细胞Arg⁃1表达约8倍(P<0.05 vs.其余各组)。结论CUR⁃siRNA共递送系统可高效转染巨噬细胞实现协同诱导其M2极化的作用。

细胞膜电位对大鼠BMMSCs基本生物学行为影响的研究

目的:探索BMMSCs膜电位对其基本生物学行为的影响及机制。方法:采用全骨髓贴壁法分离培养BMMSCs,采用电压敏感性染料DiSBAC分析细胞分化中的电位变化;分别使用乌本苷、二氮嗪诱导细胞发生去极化或超极化,采用划痕试验、CCK8、茜素红染色等手段检测细胞迁移、增殖和成骨分化能力等变化;采用Fluo-8 AM试剂盒检测胞浆钙离子浓度变化。结果:在增殖阶段BMMSCs膜电位变化不显著,而一旦换成成骨诱导液后跨膜电位急剧增加;当诱导BMMSCs发生去极化后其迁移、增殖能力显著增强,而成骨分化能力显著抑制,超极化处理后表现与之相反;发生去极化时胞浆钙离子浓度上调,超极化后钙离子浓度则显著下降。结论:BMMSCs膜电位与细胞行为密切相关。