T-exo负载DC诱导抗肝癌细胞免疫效应研究

目的：观察肝癌细胞来源的外泌体（T-exo）负载DC体外诱导细胞毒T细胞（CTL）对肝癌细胞的杀伤作用。方法：采用超滤离心技术联合蔗糖密度梯度超速离心的方法从肝癌Huh-7细胞培养上清液中分离外泌体（T-exo）,透射电镜鉴定形态,Western blot检测外泌体相关蛋白CD9、CD63、HSP70及肿瘤抗原分子AFP的表达;分离健康供者外周血单个核细胞（PBMC）培养DC,流式细胞术鉴定负载T-exo的DC细胞表型;用2-（4-碘苯）-3-（4硝基苯）-5-（2,4-磺苯基四氮唑）-2H-四唑单钠盐-1（WST-1）法检测负载T-exo的DC刺激T淋巴细胞增殖情况;流式细胞术Annexin-V/PI双染法检测负载T-exo的DC诱导CTL分别对AFP阳性Huh-7细胞及AFP阴性的SMMC7721细胞的杀伤作用。结果：透射电镜下可见T-exo为圆形或椭圆形双层膜囊泡状小体,大小不等,平均直径50～100 nm,表达外泌体膜相关分子及肿瘤抗原分子。负载T-exo的DC可促进初始T细胞增殖,T-exo致敏DC对AFP阳性的Huh-7肝癌细胞系杀伤活性明显高于AFP阴性的SMMC7721肝癌细胞组（P〈0.05）及未负载T-exo的对照组DC（P〈0.05）。结论：负载T-exo的DC能促进T细胞增殖,提高CTL细胞的细胞毒活性诱导特异性的抗肝癌效应。经T-exo抗原致敏DC诱导的CTL对肝癌细胞有明显的细胞毒作用,明显高于DC对照组（P〈0.05）。

不同方式负载AFP抗原的DC诱导抗肝癌HepG2细胞免疫效应的比较

目的:比较AFP抗原以不同方式负载DCs对后者生物学功能的影响及体外刺激CTL对肝癌Hep G2细胞的杀伤作用。方法:分离健康供者外周血单个核细胞培养DC,分别用(A)人工合成AFP抗原肽、(B)Hep G2细胞裂解物、(C)Hep G2细胞分泌的外泌体(tumor exosome,T-exo)、(D)AFP抗原的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus expressingα-fetoprotein antigen,r AAV/AFP)致敏DC前体细胞及(E)未负载抗原的DC作为对照,经GM-CSF、IL-4及LPS联合诱导DCs分化成熟。流式细胞术检测r AAV/AFP病毒感染效率、各组DCs表型及其剌激初始T细胞的增殖效应,7-ADD/CFSE双染法流式细胞术检测各组DCs诱导CTL对AFP阳性Hep G2细胞的杀伤作用。结果:几种抗原负载方式均可诱导DCs成熟、促进CTL增殖及特异性识别并杀伤Hep G2细胞,但r AAV/AFP感染DCs后,其CD83、CD86、ICAM-1、CD58、CD40分子表达水平明显高于对照组(P<0.05),r AAV/AFP+DC组和Hep G2-Texo+DC组对Hep G2细胞的杀伤作用均分别显著优于其他抗原负载(AFP/peptide+DC、Hep G2 lysate+DC)组[(44.92±4.12)%vs(28.42±3.29)%、(24.28±1.79)%;(41.40±2.87)%vs(28.42±3.29)%、(24.28±1.79)%;均P<0.05)]。结论:r AAV/AFP高效感染DCs后能有效刺激初始T细胞增殖,并增强CTL对AFP阳性靶细胞的杀伤活性,而负载Texo的DCs也能诱导显著的抗肝癌效应,上述结果为基于DCs的肝癌疫苗的研发提供新的思路。

探讨地西他滨短时刺激对RAK细胞免疫表型及抗癌活性的影响

目的:探讨地西他滨(DAC)对重组人纤维连接蛋白活化杀伤细胞(RAK)增殖、免疫表型及抗肝癌效应的影响。方法:采用RetroNectin、CD3单抗及rhIL-2诱导外周血单个核细胞以培养RAK细胞,培养第1天加入不同浓度的DAC(0、50、500、1 000、2 000、3 000 nmol/L)刺激24 h后,全量换液。培养第4、7、10、12天,采用血球计数仪进行细胞计数,CFSE检测细胞增殖水平;流式细胞术检测不同培养时间各浓度DAC刺激的RAK细胞的免疫表型;Annexin-Ⅴ/PI检测细胞凋亡水平;以CD107a、IFN-γ、穿孔素、颗粒酶-B表达水平评估各组RAK细胞的抗肝癌效应。结果:随着培养时间延长,DAC浓度越高,细胞增殖抑制越明显(P<0.05)。与对照组相比,DAC短时刺激的RAK细胞在培养10 d后,高浓度DAC组(≥1 000 nmol/L)RAK细胞CD4比例显著增加,CD8比例及CD4+和CD8+的中央记忆细胞(TCM)比例呈下降趋势(P<0.05)。培养第12天NKT水平显著升高(P<0.05),随着DAC浓度增高细胞凋亡水平显著升高(P<0.05)。与其他DAC浓度组相比,1 000 nmol/L DAC刺激组CD107a、IFN-γ、穿孔素表达显著升高(P<0.05)。结论:RAK细胞经1 000 nmol/L DAC短时刺激后,可提高CD4、CD4+TCM及NKT比例,增强对肝癌细胞的细胞毒效应。

IL-12诱导肝癌微环境中NK细胞活化发挥抗肿瘤作用

目的:探讨IL-12通过诱导肝癌微环境中NK细胞活化诱导抗肿瘤的效果。方法:NOD/SCID小鼠皮下注射肝癌HepG2细胞,成瘤后腹腔注射人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),建立HCC-huPBL荷瘤小鼠模型。将荷瘤小鼠随机分为IL-12组和PBS对照组,瘤内注射IL-12后,观测荷瘤小鼠瘤体积、体重、一般状况的变化,IL-12瘤内注射后第30天ELISA法检测荷瘤小鼠肝癌组织微环境中IL-12、INF-γ含量以及小鼠外周血中天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate amin-otransferase,AST)及谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)的含量,免疫组化法检测IL-12治疗后肝癌微环境中NK细胞活化性受体NKG2D、NKp44、NKp30、NKp46,以及抑制性受体KIR2DL3/CD158b、NKG2A/CD159a的表达。结果:第12、18、24、30天IL-12组荷瘤小鼠瘤体积均小于PBS组[(594.47±205.51)vs(832.10±187.49)mm3,(963.61±427.95)vs(1 350.87±468.23)mm3,(1 285.02±368.56)vs(1 975.49±655.54)mm3,(1 903.64±471.34)vs(2 568.77±784.68)mm3,均P<0.05]。IL-12组小鼠肝癌组织中IL-12与INF-γ的表达水平均明显高于PBS组[(2.96±1.02)vs(1.35±0.75)pg/ml,(12.26±4.11)vs(7.81±3.46)pg/ml,均P<0.05]。IL-12组与PBS组相比,血清ALT水平第7天显著升高[(73.85±10.71)vs(41.73±13.13)U/L;P<0.05],第14天达到高峰。IL-12组治疗后肝癌组织中NK细胞活化性受体NKG2D、NKp44、NKp30的表达较PBS组高(P<0.05),NKp46的表达未见明显升高;而NK细胞抑制性受体CD158b和CD159a表达较PBS组低(P<0.05)。结论:肝癌模型小鼠瘤体内IL-12注射可上调瘤组织内NK细胞活化性受体、IL-12、IFN-γ的表达,下调抑制性受体的表达,从而抑制小鼠模型中肿瘤的生长。

IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-17A在肝癌组织中表达及其与乙肝病毒感染的关系

目的:研究Th17(IL-17A)在肝细胞癌发生发展中的作用,尤其与乙肝病毒感染的关系。方法:收集39例原发性肝细胞癌患者的癌与非癌组织,应用流式细胞微球阵列术(CBA)检测IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-17A细胞因子水平,并与患者临床资料进行统计比较分析。结果:肝癌组织中IL-2、IL-4、IFN-γ表达水平好[分别为(4.61±0.28)、(3.37±0.58)、(3.08±1.08)pg/ml]显著低于非癌组织[分别为(5.57±0.59)、(3.77±0.70)、(3.69±1.20)pg/ml],而IL-6、IL-17A水平[分别为(280.09±254.68)、(2.66±1.66)pg/ml]显著高于非癌组织[分别为(6.58±1.92)、(1.49±0.98)pg/ml],同时无论癌组织还是非癌组织,高乙肝病毒载量(>1 000 U/ml)的组织IL-17A的表达[(3.45±1.86)pg/ml]显著高于低病毒载量(<1 000U/ml)的组织[(1.97±1.16)pg/ml]。结论:Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A在肝癌组织中高表达,IL-2、IL-4和IFN-γ可能抑制其表达,而IL-6可能促进其表达;乙肝病毒感染有可能促进Th17的表达,从而降低患者的预后。

肝细胞肝癌组织浸润性淋巴细胞及其因子的表达

目的:分析原发性肝细胞癌(HCC)组织中浸润淋巴细胞的分类及细胞因子表达,探讨肝癌组织免疫微环境改变的意义。方法:收集76例原发性HCC的癌组织及非癌组织标本,应用流式细胞术及免疫组化的方法分别检测组织中免疫细胞的比例;运用流式微球阵列法(CBA)检测HCC组织和非癌组织中Th1/Th2类细胞因子,ELISA法检测TGF-1、VEGF的表达。结果:HCC患者中CD3+T细胞、CD4+Th细胞、Treg细胞及CD45RO+记忆性T细胞在癌组织中的比例均高于相应的非癌组织,而CD8+CTL细胞在癌组织中的比例较低;Treg细胞与Th细胞或CTL细胞水平呈负相关;癌组织中早期活化因子CD69在CD3+T淋巴细胞及NK细胞上的表达均低于非癌组织,而癌组织中晚期活化因子HLA-DR在CD3+T细胞表达的水平高于非癌组织。细胞因子IL-10、TGF-1及VEGF在癌组织中表达高于非癌组织。结论:肝癌组织微环境中,抗肿瘤效应性细胞比例下降,而抑制性细胞及其相关因子增加,引发肿瘤浸润淋巴细胞的免疫无能,导致肿瘤发生。

原发性肝癌和癌旁组织中NK细胞受体表达及意义

目的:通过研究原发性肝癌和癌旁组织中NK细胞表面受体活化性及抑制性受体的表达,分析探讨这两种受体含量变化在原发性肝癌发生发展中的关系及其临床价值。方法:通过流式细胞术及免疫组织化学方法检测52例原发性肝癌组织及其癌旁组织中NK细胞数及其活化性、抑制性受体的表达,并结合临床相关因素进行统计学分析。结果:原发性肝癌的NK细胞数量明显低于癌旁对照组(P<0.01),原发性肝癌组织活化性受体NKG2D、NKP44明显低于癌旁组织(P<0.05),而抑制性受体CD158b、CD159a明显高于癌旁组织(P<0.05)。NKG2D、NKP30、NKP44的表达与肝癌临床分期负相关,即在早中期的患者含量较高,越晚期患者肝癌组织中NKG2D、NKP30、NKP44含量越低(P<0.05),NK细胞中抑制性受体CD158b、CD159a的含量在越晚期患者肝癌组织中含量越高(P<0.05)且与AFP高低有关及HBsAg的感染有联系。而NK受体的表达在是否有远处转移、肿瘤分化程度之间以及不同的病灶大小之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:原发性肝癌发病可能与NK细胞减低及NK细胞活化性受体表达降低、抑制性受体表达升高有关。

可溶性MICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用

目的:观察乳腺癌患者血清中可溶性MICA(sMI-CA)表达情况,探讨sMICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用。方法:ELISA方法检测乳腺肿瘤患者外周血sMICA的分泌。流式细胞术(FCM)检测sMICA及白细胞介素15(IL-15)对NK细胞表面NKG2D表达的影响。MTT法检测NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性。结果:ELISA结果显示,血清sMICA含量在健康成年人血清中为阴性,在乳腺良性肿瘤患者血清中含量为(76.8±22.3)ng/L,在恶性肿瘤患者血清中含量为(205.36±71.27)ng/L,乳腺癌患者中血清sMICA含量高低与TNM分期呈正相关。应用含sMICA的血清与NK细胞共培养可明显下调NK细胞的杀瘤活性[(76.2±6.7)%vs(48.4±4.1)%],NK细胞表面NKG2D表达和上清中IFN-γ分泌量也下降。IL-15明显上调NK细胞表面NKG2D表达,增加培养上清IFN-γ分泌量和增强NK对MCF-7的杀瘤活性。结论:sMICA表达与乳腺癌TNM分期正相关,sMICA通过下调NK细胞NKG2D表达水平而降低NK细胞杀瘤活性,在肿瘤免疫逃逸中起重要作用。IL-15可以上调NK细胞NKG2D的表达并增强NK细胞杀瘤活性。

KIR不相合的NK细胞对乳腺癌细胞的体外杀伤作用

目的:研究自然杀伤(natural killer,NK)细胞表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-like recep-tor,KIR)和HLA-Cw配体不相合的异基因NK细胞对乳腺癌细胞的体外杀伤作用;分析杀伤活化受体NKG2D及其MICA配体表达水平与NK细胞对乳腺癌细胞杀伤敏感性之间的关系。方法:取10例健康人及5例乳腺癌患者外周血10ml,采用MACS系统NK细胞免疫磁珠分选试剂盒负向分选高纯度NK细胞。取乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-435s和SK-Br3)和NK细胞各1×105个,碱裂解法抽提DNA,PCR-SSP方法分别检测HLA-Cw位点、KIR位点表达。MTT法检测KIR相合与不相合组的NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤率。流式细胞术检测NK细胞NKG2D表达水平以及RT-PCR方法检测乳腺癌细胞MICA表达。结果:MACS系统分选出的NK细胞,经流式细胞术检测,其纯度在90%以上;KIR与HLA-Cw相合组的NK细胞对乳腺癌细胞株的杀伤率明显高于不相合组,G1组和G2组NK细胞对MDA-MB-435s(G1组)杀伤率分别为(73.2±14.5)%和(34.2±7.6)%,对SK-Br3(G1组)杀伤率为(67.3±12.5)%和(36.5±7.7)%,而对MCF-7(G2组)杀伤率分别为(36.7±8.5)%和(76.5±11.7)%。结果还显示,3株乳腺癌细胞均表达MICA分子;NK细胞与MCF-7细胞共培养,可上调NK细胞表面NKG2D的表达。结论:NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤并非由KIR的不相合机制介导;乳腺癌细胞表面表达的MICA分子可上调NK细胞表面NKG2D的表达,激发NK细胞对乳腺癌细胞的细胞毒效应。

MICA分子在NK细胞杀伤乳腺癌中的作用

目的观察乳腺肿瘤细胞膜MHCⅠ链相关分子A(MHC class I chain-related gene A,MICA)及血清中可溶性MICA表达,探讨MICA在NK细胞杀伤乳腺癌中的作用。方法流式细胞术检测膜型MICA(mMICA)及NK细胞表面NKG2D表达,观察膜型MICA、可溶性MICA(sMICA)对NKG2D表达的影响;免疫组织化学检测膜型MICA及可溶性MICA的表达及分布;抗体封闭法观察膜型MICA与NKG2D相互作用。结果乳腺细胞膜型MICA在正常组织不表达,在良性肿瘤表达量为(38.5±7.5)%,恶性肿瘤表达量为(53.2±5.6)%。可溶性MICA含量在健康成年人为阴性,在乳腺良性肿瘤患者血清中含量(76.8±22.3)pg/mL,在恶性肿瘤患者中含量(205.36±71.27)pg/mL。经NKG2D或MICA抗体封闭后,NK细胞的杀瘤活性显著减弱。含可溶性MICA的血清可明显下调NKG2D的表达。结论大部分乳腺肿瘤细胞膜都有MICA的表达,可作为乳腺肿瘤相关性抗原。膜型MICA与NKG2D的相互识别在介导NK细胞抗乳腺癌中起重要作用,而可溶性MICA通过下调NKG2D表达介导肿瘤免疫逃逸。

乙型肝炎病毒X蛋白通过DNMT3A诱导肝癌细胞RUNX3基因高甲基化

目的研究肝癌细胞中乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对抑癌基因Runt相关转录因子3(RUNX3)表达的影响及相关作用机制,探讨乙肝病毒促肝癌发生的表观遗传调控。方法HBx重组表达载体转染5-aza-CdR处理或未处理的Huh7、HepG2肝癌细胞,Western Blot及RT-qPCR检测RUNX3的表达,分析RUNX3基因启动子CpG岛甲基化水平。合成DNA甲基转移酶3A的小干扰RNA(siRNA_3A)单独转染或与HBx共转染,检测RUNX3的表达。PCR检测21例手术切除的肝细胞癌新鲜组织标本HBx表达情况,比较HBx阴性与HBx阳性组织样本间RUNX3的表达差异以及启动子甲基化程度。结果过表达HBx可导致肝癌细胞内RUNX3表达下调,且甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR可完全阻断HBx对RUNX3的抑制作用。HBx诱导RUNX3基因启动子CpG岛发生高甲基化,但不影响DNA甲基转移酶的表达。siRNA_3A转染肝癌细胞后,RUNX3 mRNA与蛋白表达均显著上调;其与HBx共转染后,逆转了单独HBx对RUNX3的抑制作用。HBx阳性的肝癌组织中RUNX3mRNA表达水平较HBx阴性组低,且RUNX3启动子甲基化程度也相对较高。结论 HBx通过促进RUNX3启动子区域发生高甲基化而抑制其表达,且这一过程是由DNMT3A所介导的。

调节性T细胞对NK细胞体外杀伤乳腺癌细胞的影响

目的探讨调节性T细胞(Regulatory T cells,T-reg细胞)对NK细胞的影响及可能机制。方法流式细胞术(Flowcytometry,FCM)检测乳腺癌患者外周血中T-reg细胞、NK细胞以及T细胞亚群比例。乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)法检测NK细胞对四种乳腺癌细胞株杀伤活性。ELISA检测上清液中IFN-γ和TGF-β1含量。结果乳腺癌和健康人外周血T-reg细胞分别占CD4^+T细胞的(7.5±3.0)%和(5.1±1.5)%(P<0.01=。T-reg细胞能抑制NK细胞杀伤乳腺癌细胞,同时下调NK细胞分泌IFN-γ,上清液中TGF-β1含量随着T-reg细胞比例的增高而增加。结论T-reg细胞抑制NK细胞杀伤乳腺癌的作用,其机制与T-reg细胞分泌细胞因子TGF-β1有一定关系。

MHC半相合脾加骨髓细胞诱发H22荷瘤鼠的抗肿瘤效应

目的：观察MHC半相合脾加骨髓细胞移植抗小鼠H22实体瘤的效果。方法：以皮下接种H22肝癌细胞的BALB/c×C57BL/6杂交F1代雌性小鼠为受鼠,以健康雌性F1、雄性C57BL/6、雄性C3H小鼠为MHC全相合、半相合、不相合供鼠,观察移植后的抑瘤情况；观察供鼠细胞经^(60)Co照射的MHC半相合移植对WBC、生化和嵌合体的影响；比较供鼠细胞经与不经^(60)Co照射的MHC半相合移植的GVHD情况。结果：供鼠细胞经/不经^(60)Co照射的MHC半相合移植小鼠的肿瘤明显较小,与单纯化疗未进行移植者比较,差异具有统计学意义(P＜0．05)；但受鼠未经化疗预处理的MHC半相合细胞输注没有出现抗肿瘤效应；供鼠细胞经7．5 Gy ^(60)Co照射的MHC半相合移植能明显降低GVHD反应,且对外周血白细胞、生化无不良影响。结论：经7．5 Gy^(60)Co照射的MHC半相合脾加骨髓细胞移植能对H22肝癌细胞产生移植物抗肿瘤效应并降低GVHD反应。

抑制生长因子受体连接蛋白-2表达对乳癌细胞生长的影响

目的进一步验证生长因子受体连接蛋白-2(Grb2)的表达在乳癌发展中的作用。方法应用脂质体转染技术将Grb2小干扰RNA(siRNA)转染至乳癌细胞SKBr3中,台盼蓝计数法测定存活细胞数,TUNEL技术和AnnexinⅤ/PI染色分析转染后细胞的凋亡,免疫细胞化学技术分析转染后细胞Grb2的表达。Western蛋白质印迹法测定Grb2、细胞外信号调节激酶(p42/44ERK)、磷酸化p42/44ERK(P-p42/44ERK)、原癌基因蛋白质c-akt(Akt)、磷酸化Akt(P-Akt)和STAT5转录因子表达的改变。流式细胞术检测细胞活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3的表达。结果台盼蓝计数法结果显示,转染Grb2siRNA可有效抑制SKBr3的生长。TUNEL实验显示,Grb2siRNA转染SKBr3细胞后,随着时间延长,凋亡细胞明显增加。AnnexinⅤ/PI测定结果亦提示,Grb2的抑制可明显诱导SKBr3细胞凋亡。转染48h后,SKBr3的活化caspase3表达水平由0.99%升至17.43%。免疫组化染色表明,Grb2siRNA转染细胞后,SKBr3细胞Grb2表达明显下降,由转染24h后的下降至转染72h后的+～-。Western蛋白质印迹分析证实,Grb2的抑制可导致SKBr3细胞P-p42/44ERK,P-Akt以及STAT5表达明显下降。P-p42ERK与p42ERK的相对吸光度值之比由未转染的(60±17)%下降至转染24h后的(38±13)%,及转染48h后的(21±8)%;P-p44ERK与p44ERK的相对吸光度值之比,由未转染时(104±16)%,分别下降至(49±13)%及(30±10)%;P-Akt与Akt的相对吸光度值之比由未转染的(40±6)%下降至(32±10)%和(15±4)%。与未转染组相比,转染24及48h后STAT5相对吸光度值分别下降为(64±6)%和(52±14)%。结论抑制Grb2的表达可抑制乳癌细胞生长并诱导细胞凋亡。

体外扩增对食管癌患者NK细胞表面受体表达及其抑瘤活性的影响

目的:探讨食管癌患者NK细胞扩增前后的受体表达及其对肿瘤细胞的杀伤。方法:收集福建省肿瘤医院食管癌患者外周血20例,健康供者(对照组)外周血10例。NK细胞培养采用细胞因子(IL-2+IL-12+IL-15+IL-18)组合,流式细胞术检测NK细胞免疫表型及其受体(CD56+、CD69+、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD158b、CD159a)的表达,LDH法检测不同效靶比时NK细胞对多种肿瘤细胞株(K562、Raji、Eca-109、TE-1)的杀伤作用。结果:与对照组相比,食管癌患者外周血CD3+、CD4+细胞比例以及CD4+/CD8+T细胞比值明显降低(P<0.05),NK细胞(CD3-CD56+)及调节性T细胞(Treg)比例明显升高(P<0.05)。经细胞因子IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合定向扩增20 d后,食管癌患者NK细胞比例高达90%以上,NK细胞数扩增达1 000倍以上(P<0.01);而CD3+T细胞、CD4+、CD8+T细胞、CD19+B细胞、Treg细胞及单核巨噬细胞(CD14+)比例均显著降低(P<0.01),且食管癌患者与对照组之间无统计学差异(P>0.05)。经细胞因子体外培养20 d后,NK细胞表面CD69及活化性受体(NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46)均明显上调,而抑制性受体(CD158b、CD159a)均明显下调(P<0.05)。培养20 d后,食管癌患者NK细胞对肿瘤细胞K562、Raji、Eca-109、TE-1的杀伤能力均显著高于培养前[(69.2±5.1)%vs(42.3±3.0)%,(44.6±3.2)%vs(21.1±2.0)%,(69.7±3.9)%vs(50.3±3.5)%,(67.1±4.5)%vs(41.2±3.3)%;均P<0.01]。结论:细胞因子IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合能有效扩增外周血NK细胞并上调其活并性受体的表达、下调抑制性受体的表达,其数量及功能均能满足临床治疗需要。

食管癌中MICA的表达及其意义

目的:观察食管癌细胞株组织膜MHCⅠ链相关分子A(MHC class Ⅰ chain-related gene A,MICA)及血清中可溶性MICA表达,探讨食管癌中MICA的表达及其临床意义。方法:流式细胞术检测膜型MICA(mMICA)及NK细胞表面NKG2D表达,ELISA方法检测乳腺肿瘤患者外周血可溶性MICA(sMICA)的分泌。分组实验分析可溶性MICA(sMICA)对NKG2D表达的影响。结果:食管细胞膜型MICA在食管癌旁组织无表达,在31.7%食管癌组织有表达,表达量为(42.2±3.6)%。可溶性MICA含量在健康成年者为阴性,食管癌患者中74.67%阳性,含量为(1977.30±292.67)ng/L。食管癌患者中血清sMICA含量高低与TNM分期呈正相关,远处转移组比无远处转移组高(P<0.05),但和病理类型表达无差异。含可溶性M!CA的血清可明显下调NK细胞NKG2D的表达,从而降低NK细胞对食管癌细胞株ECA-109的杀伤活性。结论:食管癌细胞膜表达MICA,可作为食管肿瘤相关性抗原。而可溶性MICA含量高低与TNM分期呈正相关,可通过下调NK细胞NKG2D表达介导肿瘤免疫逃逸。

NKG2D配体在中晚期食管癌患者术后NK细胞免疫治疗中的作用

目的:探讨NKG2D配体MHC-I类相关分子A(MHC class I-related molecules A,MICA)在中晚期食管癌患者术后化疗联合NK细胞免疫治疗中的作用。方法:福建省肿瘤医院90例中晚期食管癌患者手术后,分为单纯化疗组40例、化疗联合NK细胞治疗MCIA阴性组(简称MICA-组)25例及化疗联合NK细胞治疗MICA阳性组(简称MICA+组)25例,比较其疗效。结果:与单纯化疗组及MICA-组相比,MICA+组CD3+、CD4+T细胞阳性率、NK细胞阳性率及CD4+/CD8+比率明显高于治疗前[(64.2±6.4)%vs(51.3±5.6)%,(39.8±8.2)%vs(29.5±3.2)%,(25.3±2.1)%vs(16.4±4.3)%,(1.4±0.5)vs(1.1±0.7);均P<0.05],T-reg细胞明显低于治疗前[(6.3±4.5)%vs(17.3±2.4)%,P<0.05]。3组疾病控制率及有效率无明显差异(P>0.05)。MICA+组KPS评分治疗后明显提高,MICA+组能明显改善化疗引起的白细胞减少、外周神经毒性症状,MICA+组疾病进展时间(time to progression,TTP)及总体生存时间(overall survival,OS)均明显延长(均P<0.05)。但单纯化疗组及MICA-组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:食管癌组织MICA表达阳性的中晚期患者进行化疗联合自体NK细胞能有效能有效提高免疫力,改善患者生活质量,并能延长生存期,且回输安全、不良反应小。

GBX2过表达促进人宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移及侵袭

目的:探讨GBX2基因在人宫颈癌SiHa细胞增殖和侵袭转移中的作用及其机制。方法:应用质粒转染技术,分别将过表达GBX2基因重组质粒pCMV6-entry-GBX2(实验组)及空载体质粒pCMV6-entry(阴性对照组)转染到宫颈癌SiHa细胞中,用WST-1法、集落形成实验、流式细胞术分别检测转染细胞的增殖、集落形成和细胞周期,用划痕愈合实验、Transwell实验检测细胞的迁移、侵袭能力,用ELISA法检测细胞培养上清中IL-6的表达水平,用WB检测EMT相关蛋白的表达变化并探讨其可能的作用机制。结果:与SiHa/pCMV6组相比,上调GBX2表达后:(1)SiHa/GBX2组细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力明显增强(均P<0.01),G0/G1期的细胞比例减少、S期与G2/M期的细胞比例增加(均P<0.01)(;2)SiHa/GBX2组细胞EMT相关蛋白上皮钙黏蛋白表达水平下降,神经钙黏蛋白、波形蛋白和snail表达水平上调(均P<0.01)(;3)SiHa/GBX2组细胞培养上清中IL-6的表达水平明显增高(P<0.01);(4)SiHa/GBX2组细胞STAT3磷酸化水平增强,并能被STAT3抑制剂S31-201抑制(P<0.01)。结论:GBX2可能通过IL-6/STAT3通路诱导宫颈癌SiHa细胞EMT,从而促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

MICA表达预测非小细胞肺癌术后化疗联合NK细胞输注治疗的疗效

目的探讨MHC-Ⅰ类相关分子A(MHC classⅠ-related molecules A,MICA)表达是否能预测非小细胞肺癌术后化疗联合NK细胞输注治疗的疗效。方法流式细胞仪检测92例非小细胞肺癌组织MICA表达。非小细胞肺癌患者手术后,单纯化疗41例(多西他赛+顺铂方案)、化疗联合NK细胞治疗51例,单因素与多因素比较临床因素与生存期关系。结果非小细胞肺癌组织46.74%MICA阴性表达,53.26%MICA阳性表达,NK细胞培养14~17 d后NKG2D高达(97.8%±2.5)%,明显高于培养前(88.2%±7.2)%(P<0.05)。MICA是否表达与NKG2D高低无关(P=0.189)。非小细胞肺癌患者术后Ⅱ期患者的3年及5年的生存率分别为70.8%及47.9%,ⅢA期患者的3年及5年的生存率分别为54.5%及22.7%,中位生存期在是否联合NK治疗(P=0.037)及临床分期(TNM)(P=0.009)存在差异,而患者在年龄(P=0.999)、性别(P=0.412)、病理类型(P=0.782)及MICA表达(P=0.172)均无差异。多因素分析显示,中位生存期在是否联合NK治疗(P=0.044)、临床分期(TNM)(P=0.002)及NK与MICA交叉分析(P=0.002)存在差异。结论 MICA在非小细胞肺癌患者术后化疗联合NK细胞免疫治疗中起重要作用,MICA表达可作为NK细胞免疫治疗的预后因素。

7-羟基异黄酮通过Id1影响结直肠癌细胞增殖

目的:探讨7-羟基异黄酮(7-HIF)对结直肠癌细胞增殖、凋亡和干细胞相关特性的影响。方法:采用WST-1法和集落形成实验检测7-HIF对人结肠癌HCT116细胞增殖的影响;流式细胞术检测7-HIF对HCT116细胞细胞周期分布和凋亡的影响;Western blot法检测细胞周期相关分子和干细胞相关分子的表达。结果:在200μmol/L的7-HIF作用下,HCT116细胞的活力受到明显抑制,形成的细胞集落数及大小明显减少(P<0.05);细胞周期G0/G1的比例上升,S期的比例下降,主要阻滞在G0/G1期;HCT116细胞的凋亡率较对照组明显增加(P<0.05)。7-HIF可降低HCT116细胞中分化抑制因子1(Id1)的蛋白表达水平,导致细胞周期相关蛋白cyclin D1和cyclin E的表达下降,增殖相关蛋白survivin和PCNA的表达也明显下降(P<0.05)。7-HIF还能降低干细胞相关标志分子CD133、ALCAM和EpCAM的表达水平(P<0.05)。结论:7-HIF能抑制结直肠癌细胞的增殖,诱导结直肠癌细胞的凋亡,并影响其干细胞相关特性,可能与其抑制Id1的表达有关。