半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶caspase-1抑制剂体外筛选模型的构建及应用

半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶caspase-1(Cystein-containing aspartat-specific protease-1)通过介导白介素-1β和18(interleukin-1β,IL-1β;interleukin-18,IL-18)及Gasdermin D的成熟,启动炎症反应并诱导细胞焦亡,参与多种疾病的发生发展.因此构建出高效稳定的caspase-1抑制剂筛选模型对于发现新型caspase-1小分子抑制剂并深入研究caspase-1功能具有重要意义.通过应用大肠杆菌系统克隆表达可溶的人源caspase-1蛋白活性区域,以VX-765为阳性抑制剂,建立caspase-1抑制剂体外筛选模型,对实验室化合物文库中868个化合物进行筛选.结果显示,黄酮类化合物E-3-(4-(diethylamino)-benzylidene)-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-methoxychroman-4-one(CIB-1710),在体外对caspase-1活性有良好的抑制作用,其IC50为36.27μmol/L.进一步研究发现CIB-1710在小鼠单核巨噬细胞系J774A.1上可抑制由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及尼日利亚菌素(nigericin)刺激所诱导的IL-1β释放,且在高浓度下不影响细胞活力;分子对接显示CIB-1710可与caspase-1蛋白的催化活性结构域高亲和力结合来抑制蛋白的剪切活性;透析实验显示CIB-1710可逆抑制caspase-1剪切活性.综上所述,本研究所建立的caspase-1抑制剂体外筛选模型为发现新型高效的caspase-1小分子抑制剂提供了高效低成本的途径,所发现的活性化合物CIB-1710可作为caspase-1抑制剂开展进一步研究.(图7表1参30)

氯氰碘柳胺钠通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2诱导RAS突变型肺癌细胞衰老和死亡

含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)具有调控细胞增殖分化、维持周期、调节免疫等功能,与众多肿瘤的发生发展密切相关.SHP2是RAS蛋白(ratsarcoma protein,RAS)信号通路的重要调控蛋白,研究表明抑制SHP2活性能减缓RAS突变肺癌的进展.因此筛选特异性的SHP2抑制剂,有助于为肺癌的治疗提供新的手段.通过建立不同蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTP)体外筛选体系,从化合物文库中筛得SHP2特异性抑制剂氯氰碘柳胺钠(closantel sodium,CS),其IC_(50)值为84.83μmol/L.采用Western Blot检测CS对SHP2磷酸化的抑制作用;采用细胞热转移试验(cellular thermal shift assay,CETSA)检测在不同温度及浓度下CS对SHP2的热稳定性的影响;采用CCK8检测CS对人肺癌细胞A549、NCI-H358、NCI-H1944的细胞毒作用;采用β-半乳糖苷酶染色检测CS在无血清(0%)、低血清(3%)及常规血清(10%)3种条件下诱导肺癌细胞衰老表型.结果显示,CS可特异性抑制SHP2的活性,并显著抑制SHP2的磷酸化;在52-60℃的温度范围内,CS可稳定胞内SHP2构象,并具有浓度依赖性;CS可抑制肺癌细胞增殖,并具有浓度依赖性;10%血清条件下,CS作用使得细胞衰老表型显著增加,可诱导肺癌细胞衰老.本研究表明CS可通过抑制SHP2活性及磷酸化诱导肺癌细胞衰老、促进肺癌细胞死亡,结果可为开发新的治疗肺癌等疾病的特异性SHP2抑制剂提供新的化合物骨架.(图5表2参36)