双三倍体银鲫超数微小染色体的基因组特征

为了揭示双三倍体银鲫超数微小染色体基因组特征,利用银鲫超数微小染色体富集的卫星序列及染色体荧光原位杂交,鉴定了银鲫基因组数据库中超数微小染色体序列,并对这些序列进行了基因组解析。研究发现在银鲫基因组数据库中存在15个scaffold为潜在超数微小染色体序列,这些序列中的22.28%与其祖先种双二倍体鲫的常规染色体存在同源性。双三倍体银鲫超数微小染色体重复序列含量明显高于双二倍体鲫和双三倍体银鲫的常规染色体,且重复序列组成也存在差异。随后,研究发现在银鲫中扩张的与减数分裂相关的8个基因家族,有6个在超数微小染色体序列上含有扩增拷贝,且这些扩增拷贝在银鲫卵子发生过程中具有转录活性。此外,根据超数微小染色体扩增拷贝的特异性序列开发了3个超数微小染色体特异的SCAR标记,可以用来区分双二倍体鲫和双三倍体银鲫。研究结果表明,双三倍体银鲫超数微小染色体起源于常规染色体,演化过程中积累了大量重复序列和部分活性基因,且大多数减数分裂相关基因的扩张通过超数微小染色体完成。研究结果不仅解析了双三倍体银鲫超数微小染色体基因组特征,也为超数染色体在单性生殖演化中的作用提供了创新见解。

异育银鲫A^+系和F系肌间骨的比较分析

研究采用常规测量法和解剖法,并结合CT透视,比较分析了异育银鲫主养品种"中科3号"(A^+系)和候选新品系F系的肌间骨的数目、形态和分布。结果表明,6月龄和18月龄异育银鲫F系平均总肌间骨数分别为71.8±2.9和83.3±1.4,均极显著少于相应月龄银鲫A^+系总肌间骨数目(78.6±3.9和87.0±1.5)(P<0.01)。并统计了2个品系的每一肌节的平均肌间骨数目,6月龄和18月龄异育银鲫F系的每一肌节的平均肌间骨数目极显著少于相应月龄银鲫A^+系(P<0.01)。银鲫A^+系和F系均有髓弓小骨和脉弓小骨,没有椎体小骨。6月龄和18月龄银鲫F系髓弓小骨的平均数目为48.2±1.1和55.8±0.52,均极显著少于相应月龄银鲫A^+系的髓弓小骨(53.7±1.6和58.7±0.5)(P<0.01)。异育银鲫两个品系的脉弓小骨数目差异不显著;2个品系均具有"I"形、"卜"形、"Y"形、一端多叉形、两端两分叉形、两端多叉形和树枝形7种类型的肌间骨,髓弓小骨比脉弓小骨数量多且形状复杂。随着月龄的增长,2个品系具有的总肌间骨数目以及复杂肌间骨数目均增加。6月龄和18月龄银鲫F系躯轴上肌节间的复杂"Y"形髓弓小骨数目均比相应月龄的银鲫A^+系少,而简单的"I"形髓弓小骨数目比相应月龄的A^+系多,表现出一种有利于食用的优势。研究结果为异育银鲫候选新品系F系提供了一个品质评价指标,同时也为后续进行异育银鲫肌间骨遗传改良提供了形态学基础资料。

外源精子基因组整入雌核生殖银鲫卵子创制异源八倍体的有效方法

银鲫(Carassius auratus gibelio Bloth)具有将其他鱼类精子的染色体组、染色体片段并入到卵核中协同发育的能力,但通过异精雌核生殖自发形成异源八倍体子代的概率极低。研究采用0.25%、0.5%、1%、2%和4%胰蛋白酶溶液处理白鲫精子10min后以及1%胰蛋白溶液处理白鲫精子5min、10min、15min、20min和25min后,分别与异育银鲫A+系成熟卵子受精;接着通过比较对照组和不同处理组合中精子结构和活力的变化,兼顾受精率、孵化率、成活率等繁育指标与较高的子代八倍体率,建立了一种将外源精子基因组整入雌核生殖银鲫卵子创制异源八倍体的有效方法。即采用1%胰蛋白溶液处理白鲫精子15min后与异育银鲫A+系成熟卵子受精,子代的平均存活率为(2.4±0.7)%,平均八倍体率可达(16.3±0.5)%。批量处理并结合流式细胞术筛选6月龄子代,获得57尾融入有白鲫精子染色体组的异源八倍体成鱼。研究为创制异育银鲫优异异源八倍体种质提供了一个简单易行的方法,创制的异源八倍体可作为后续培育生长快、抗病能力强的银鲫新品种的核心育种材料。

银鲫卵母细胞体外诱导成熟技术的建立

研究以银鲫为材料,根据银鲫(Carassius auratus gibelio)卵母细胞生发泡(Germinal vesicle,GV)边移程度及剥离GV中减数分裂前期染色体的凝集状态,将银鲫Ⅳ时相的卵母细胞分为GV0、GV1、GV2和GV3四个时期;并进一步比较了分别处于这4个时期银鲫卵母细胞体外诱导培养的成熟率、卵裂率和孵化率。结果表明,GV1期之后的卵母细胞均可有效进行体外诱导成熟,可正常受精发育,由于GV1期卵母细胞有较长时间用于显微操作,因此GV1期卵母细胞被选为进行体外诱导的最早时期的卵母细胞。以GV1期卵母细胞为研究材料,摸索了银鲫卵母细胞体外诱导成熟的适宜条件:取GV1期的Ⅳ时相卵母细胞,放置于pH 8.5、加有1μg/m L孕酮激素(17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one,DHP)的格氏平衡盐溶液(Gey’s balanced salt solution,GBSS)中,在23℃培养箱中体外诱导12h后,将滤泡膜剥离后再进行人工体外授精,其所获胚胎的孵化率可达55.5%。此外,将体外转录合成的带GFP标签的h2af1o m RNA注射到GV1期卵母细胞,发现经显微操作和体外诱导后不仅可以通过GFP绿色荧光信号活体观察GVBD、受精、卵裂和早期胚胎发育的全过程,而且诱导成熟的卵子仍可正常受精和胚胎发育。研究建立的银鲫卵母细胞体外诱导成熟技术为银鲫和其他鱼类卵母细胞发育过程研究及其相关基因和细胞显微操作提供了技术平台。

一个可区分银鲫F系和A^＋系BAC序列的特征、染色体定位和SCAR标记筛选

为了揭示F系和A^+系的遗传差异以及解析F系的遗传特征,研究基于前期基因组Survey分析发现一个特异于银鲫F系大小为782 bp片段的基础,首先采用混合池筛选方法从银鲫F系BAC文库中筛选出一个包含该特异片段的BAC克隆(F782-BAC)。鸟枪法测序结果表明,F782-BAC序列全长大小为172625 bp,富含转座子序列,包含1个具备完整结构的Tc1-like转座子,以及不具备完整结构的transposase-like、PIF/Harbinger、target-primed reversed transcription(TPRT)和transpon X-element等6个转座子。用地高辛标记F782-BAC质粒得到的DNA探针进行了银鲫F和A^+系有丝分裂中期相的染色体荧光原位杂交,结果表明不论是在F系还是A^+系的有丝分裂中期相中,3个阳性荧光信号皆清晰地定位于3条大小相同的近端着丝粒染色体短臂的近着丝粒位置。进一步开展了银鲫A^+系相应同源的F782-BAC序列的差异鉴定和序列分析,揭示A^+系缺失了大小为3395 bp的一段序列,且特异于银鲫F系大小为782 bp的片段正好位于其中,并由此筛选出可作为区分银鲫F系和A^+系的SCAR标记。研究为银鲫的多倍化起源提供了进一步的染色体定位证据,鉴定的SCAR标记可为银鲫分子标记辅助育种提供新的遗传标记。

一种独特的无减数融合生殖方式的发现及一条合成不育异源多倍体高效路径的创建

多倍化与生殖方式转换之间的联系作为进化遗传学的热点,能被开拓为农业生物遗传改良的新路径.最近我们通过整合雌核生殖银鲫和有性生殖鲫的基因组,创制了一个新双三倍体群体,发现它们中的大部分雌性恢复了单性雌核生殖能力.在本研究中,我们发现少数雌性获得了一种定义为“无减数融合生殖”的独特生殖方式.具有这种生殖方式的新双三倍体雌性不仅从单性雌核生殖银鲫遗传了无减数分裂产生不减数卵子的能力,还从有性生殖鲫遗传了卵核与精核融合形成受精卵的能力.随后我们将这种新双三倍体与二倍体团头鲂进行交配,直接创制了一个合成异源七倍体群体.它们的染色体组由来自其母本新双三倍体鲫的全套染色体组和来自父本二倍体团头鲂的一套染色体组构成.此外,我们还在一尾异源七倍体的部分体细胞中,检测到鲫与团头鲂染色体间相互易位的现象.随后我们追踪了异源七倍体生殖细胞在减数分裂过程中的染色体行为,揭示了它们不育的细胞学机制.结果表明,在减数第一次分裂(减Ⅰ)前期,染色体联会异常以及DNA双链断裂无法被完全修复,导致异源七倍体初级卵母细胞严重凋亡.尽管其初级精母细胞在减Ⅰ前期表现出与初级卵母细胞相似的染色体行为,但它们可以发育到减Ⅰ中期,并最终由于同源染色体分离失败而发生凋亡.最后,我们建立了一个可持续大规模生产具有无减数融合生殖能力的新双三倍体克隆系,还将其与多种鲤科鱼类进行交配快速创制出多种整合有不同鲤科鱼类基因组的不育异源多倍体群体,由此研发出一条高效的育种技术路径.本研究不仅拓宽了我们对脊椎动物生殖方式转换的认识,还为多倍体育种和杂种优势固定提供了一个可行的策略.