阳和汤治疗兔膝骨关节炎阳虚寒凝证的效果及作用机制

目的:探讨阳和汤治疗膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)阳虚寒凝证的效果及作用机制。方法:将24只新西兰兔随机分为正常对照组和造模组,正常对照组6只,造模组18只。造模组兔采用双侧后肢膝关节腔内注射木瓜蛋白酶建立KOA模型,同时采用薄荷油灌胃联合4℃人工气候箱饲养建立阳虚寒凝证模型。造模成功后将18只KOA阳虚寒凝证兔随机分为模型组、阳和汤干预组和塞来昔布干预组,每组6只。阳和汤干预组兔按照中药饮片3 g·kg-1的剂量给予阳和汤浓缩剂灌胃,塞来昔布干预组按照0.02 g·kg-1的剂量给予塞来昔布溶液灌胃,模型组和正常对照组给予等量生理盐水灌胃。每日给药1次,连续给药2周。末次给药后当天,采用改良版Lequense MG评分标准评价兔膝关节疼痛及功能,采用桂苗等制定的阳虚证候评分表及寒凝证候评分表评价兔阳虚寒凝证候改善情况。末次给药后禁食不禁水24 h,处死兔并取材,采用HE染色观察膝关节滑膜组织病理改变,采用实时定量PCR检测膝关节滑膜组织中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的mRNA表达量,采用蛋白免疫印迹法检测膝关节滑膜组织中TLR4、NF-κB的蛋白表达量,采用酶联免疫吸附法测定膝关节液中白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量。结果:阳和汤干预组和塞来昔布干预组兔膝关节改良版Lequesne MG评分、阳虚寒凝证候评分均小于模型组(阳和汤干预组:P=0.000,P=0.000;塞来昔布干预组:P=0.000,P=0.000);阳和汤干预组兔膝关节改良版Lequesne MG评分与塞来昔布干预组的差异无统计学意义(P=0.751),阳虚寒凝证候评分小于塞来昔布干预组(P=0.000);阳和汤干预组和塞来昔布干预组膝关节滑膜表面较为平整,衬里层细胞层数较模型组减少,细胞排列较为紧密;衬里下层仍可见较多脂肪细胞分布,可见少量炎性细胞浸润,纤维组织、血管少量增生;阳和汤干预组和塞来昔布干预组兔膝关节滑膜组织中TLR4和NF-κB的mRNA表达量及蛋白表达量均小于模型组(阳和汤干预组:P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000;塞来昔布干预组:P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.000);阳和汤干预组和塞来昔布干预组兔膝关节液中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均小于模型组(阳和汤干预组:P=0.000,P=0.000,P=0.000;塞来昔布干预组:P=0.000,P=0.000,P=0.000)。结论:阳和汤治疗KOA阳虚寒凝证,能够显著缓解膝关节疼痛,改善膝关节功能、阳虚寒凝证候及膝关节滑膜组织病理表现,在缓解膝关节疼痛和改善膝关节功能方面与塞来昔布相当,在改善阳虚寒凝证候方面较塞来昔布更具优势;其作用机制可能是通过下调TLR4、NF-κB的表达,抑制TNF-α、IL-6及IL-1β等炎症因子的表达。

ERK1/2信号通路在3种骨肉瘤细胞中的作用和表达水平的研究

目的观察细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)激动剂表皮生长因子(EGF)和抑制剂PD98059对3种骨肉瘤细胞株U2OS、MG63、UMR106的增殖影响以及ERK1/2基因和蛋白在3种细胞株中的表达水平,筛选出ERK1/2基因和蛋白表达最高的骨肉瘤细胞株用于后续实验研究。方法采用细胞计数和CCK8法分别测定U2OS、MG63、UMR106细胞的生长情况,同时使用EGF和PD98059分别干预3种细胞株,观察其对3种骨肉瘤细胞增殖的影响;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测3种细胞株中ERK1/2基因的表达;采用Western-blot检测3种细胞株中ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达情况。结果细胞计数和CCK8结果均显示,U2OS和UMR106在正常情况下培养48 h可达最佳生长状态,而MG63细胞的最佳生长状态时间为24 h;EGF在干预细胞24 h和48 h均能使U2OS、MG63、UMR106细胞增殖,而PD98059在干预细胞24 h和48 h均能使3种细胞的增殖受到抑制(P<0.05)。RT-qPCR结果显示在培养48 h后,U2OS细胞中的ERK1/2基因表达水平最高。Western-blot结果显示在培养48 h后,U2OS细胞中ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达水平最高,UMR106细胞次之,而MG63细胞中ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达水平最低(P<0.05)。结论U2OS细胞株生长期长,增殖活力强,同时ERK1/2基因、蛋白以及p-ERK1/2蛋白的表达水平高,适合用于骨肉瘤ERK1/2信号通路的研究。

阳虚寒凝型兔膝骨关节炎模型建立初探

目的初步探讨建立阳虚寒凝型兔膝骨关节炎(KOA)模型的评价指标。方法将24只4月龄新西兰大白兔按随机数字表法分为正常组、木瓜蛋白酶组、阳虚组、阳虚寒凝组,每组6只。正常组不予干预,常规饲养;其余3组均用4周造模,在第1周的第1、4、7天均关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液0.1 mL建立KOA模型;阳虚寒凝组从第1周开始持续4周每日置于湿度为50%~60%、温度为4~6℃恒温恒湿培养箱中不限活动1.5 h,第3周以0.65 mL/(kg·d)薄荷油连续灌胃2周;阳虚组第3周开始以薄荷油连续灌胃2周。造模后比较4组兔膝关节周径、LequesneMG评分、膝关节软骨及滑膜病理学改变、软骨损伤改良Mankin's评分、关节液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量以及体质量、肛温、心率、中医证候评分。结果与正常组比较,造模后木瓜蛋白酶组、阳虚组、阳虚寒凝组膝关节周径、LequesneMG评分及关节液中IL-1β、TNF-α含量均明显升高(P<0.05),膝关节软骨、滑膜病理切片损伤情况均显著加重,改良Mankin's评分均显著升高(P均<0.05);与木瓜蛋白酶组比较,阳虚组与阳虚寒凝组体质量、肛温、心率均显著降低(P均<0.05),阳虚寒凝组中医证候评分显著升高(P<0.05);与阳虚组比较,阳虚寒凝组体质量、肛温、心率及中医证候评分均显著降低(P均<0.05)。结论关节腔注射木瓜蛋白酶加薄荷油灌胃及恒温恒湿培养箱中不限活动培养,在一定程度上可以建立兔阳虚寒凝证模型。

阳和汤调节磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路抑制骨关节炎软骨退变的机制

目的:基于PI3K/AKT/BCL-2/BAX信号通路探讨阳和汤对膝骨关节炎的作用及相关机制。方法:将24只新西兰大白兔随机分为空白组、木瓜蛋白酶组、阳和汤组和塞来昔布组共四组,每组各6只。其中除空白组外均采用膝关节腔注射木瓜蛋白酶建立骨关节炎模型。在造模结束后,阳和汤组和塞来昔布组分别喂药阳和汤和西药塞来昔布治疗,1次/d,连续4周,空白组和模型组则不进行干预。采用苏木精-伊红(HE)染色观察骨关节炎兔膝关节软骨层次结构的形态变化,并行改良Mankin's评分。Western Blot和RT-qPCR分别检测软骨PI3K、AKT、BCL-2、BAX的蛋白和mRNA表达。结果:改良Mankin's评分比较,与空白对照组相比,模型组评分较空白组显著升高(P<0.01),阳和汤组和塞来昔布组较模型组显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-qPCR与Western Blot结果显示,与空白组比较,模型组显著下调PI3K、AKT、BCL-2mRNA和蛋白的表达(P<0.01),同时上调BAX mRNA和蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,阳和汤组和塞来昔布组上调了PI3K、AKT、BCL-2mRNA和蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05),下调BAX mRNA和蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。其中,模型组、阳和汤组、塞来昔布组的BCL-2/BAX蛋白表达比值显著低于空白组,差异有统计学意义(P<0.01),阳和汤组、塞来昔布组BCL-2/BAX蛋白表达比值显著高于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:阳和汤能修复软骨损伤,抑制关节软骨退行性改变,延缓骨关节炎病程进展,其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路,促进BCL-2的表达,抑制BAX表达,上调BCL-2/BAX值,进而抑制软骨细胞凋亡有关。