马铃薯蔗糖磷酸合成酶StSPS1的原核表达及抗体制备

为了对马铃薯蔗糖磷酸合成酶(SPS)编码蛋白StSPS1进行原核表达及多克隆抗体制备。从四倍体马铃薯品种川芋10号的块茎中克隆出了StSPS1基因,该基因编码区全长为3165 bp,编码蛋白的长度为1055 aa。随后基于构建的His标签融合表达载体PET30a-StSPS1,进行了StSPS1蛋白的诱导、变性、纯化、复性及兔免疫试验。结果发现,StSPS1蛋白分子量约为119.62 ku,在可溶性上清中的表达极少,主要在不溶的沉淀中表达,最佳的诱导条件为37℃下用0.5或1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h。由于StSPS1为包涵体蛋白,故对其进行包涵体变性处理,并利用His标签纯化出了与目的条带大小相符的蛋白,同时通过His抗体进行了蛋白质免疫印迹(WB)试验,发现在119.62 ku处检测到目标条带,说明StSPS1包涵体蛋白纯化成功。最后,通过将透析复性后的StSPS1蛋白注射进兔子皮下组织中,成功免疫出2个StSPS1的抗体,经过WB鉴定发现2个抗体均能在抗原和川芋10号叶片的总蛋白中杂出目标条带。综上,对马铃薯StSPS1蛋白进行了诱导及纯化,并成功制备了StSPS1蛋白的兔多克隆抗体。

镉胁迫对烟草幼苗生长和生理指标的影响

利用不同浓度的CdCl2培养液处理K326水培幼苗3 d后,测定其叶与茎的干重百分率、叶片叶绿素含量、MDA含量、SOD活性和游离脯氨酸含量,以研究镉胁迫对K326幼苗生长的影响。结果表明,叶与茎的干重百分率随CdCl2浓度的上升均先升后降,幼苗叶片叶绿素含量的明显降低,MDA含量是先升后降,游离脯氨酸含量和SOD活性明显增加。表明,CdCl2浓度高于15 mg/L时烟草幼苗将不能正常生长。

马铃薯WRKY6基因的克隆、序列分析与原核表达研究

在高等植物中WRKY转录因子家族成员众多,它广泛参与植物对生物胁迫、非生物胁迫、生长发育和代谢过程的调控。本研究采用同源序列克隆的方法获得马铃薯WRKY6基因,序列分析表明该蛋白属于WRKY家族第3组成员,锌指结构为C-X7-C-X23-H-X-C。构建系统发育树结果表明它与拟南芥WRKY70亲缘关系较近,相似性达58%。然后将其完整编码区构建到大肠杆菌表达载体。在培养温度18℃条件下添加0.2 mmol/L IPTG(异丙基硫代半乳糖苷),诱导培养8 h可获得高表达融合蛋白。进一步实验获得特异性和纯度非常高的纯化蛋白。本研究为进一步确定该蛋白的体外活性及生物学功能奠定了坚实基础。

马铃薯WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式

马铃薯WRKY2基因的功能尚未见有报道,WRKY蛋白是近年来发现的一类重要转录因子家族,它们在植物应对生物胁迫、非生物胁迫和生长发育过程中起到关键的调控作用。该研究采用电子克隆法获得马铃薯WRKY2基因,该基因的编码区长度1 065 bp,编码355氨基酸,序列分析表明,该蛋白属于WRKY家族第二组成员,锌指结构为C-X5-C-X23H-X-H。构建系统发育树结果表明它与番茄WRKY7亲缘关系较近,氨基酸序列相似性达96%,与烟草中WRKY蛋白的相似性为86%,利用原核表达法在大肠杆菌中获得该蛋白。通过凝胶阻滞实验证明,该蛋白在体外能结合W-box元件,而且这种结合能被冷探针所竞争,同时也表明St WRKY2不能结合含有突变W-box DNA片段,证明St WRKY2与W-box结合具有特异性。通过实时荧光定量PCR技术分析该基因在根、茎和叶中的表达量,结果表明该基因主要在根中表达,其次是叶和茎。为进一步研究该基因可能参与的生理功能,对马铃薯组培苗进行10μmol/L低磷、10μmol/L低钾、200 mmol/L Na Cl、400 mmol/L PEG溶液和4℃低温处理,处理时间6 h,实时荧光定量PCR的结果表明该基因在低磷处理后表达量明显下降,在200 mmol/L Na Cl和400 mmol/L PEG处理6 h后表达量明显升高,但在10μmol/L低钾和4℃低温处理后表达量与对照相比无明显变化。说明St WRKY2能响应低磷、Na Cl和PEG这三种非生物逆境胁迫。研究结果可为进一步深入研究马铃薯WRKY2基因的功能奠定基础。

抑制性消减杂交技术(SSH)及其在烟草生物学研究中的应用

抑制性消减杂交技术(SSH)是基于抑制性PCR及差减杂交技术建立的一种新技术。目前,由于该技术具有速度快、假阳性率低、灵敏程度高等优点,在植物学研究的各个领域得到了广泛的应用。对该技术的原理和方法、主要优缺点及其在烟草研究中的应用进行了综述。

烟草WRKY12基因的分离、表达与多克隆抗体的制备

在高等植物中,WRKY转录因子家族成员广泛参与植物的生长发育、代谢、生物胁迫和非生物胁迫等生理过程的调控。本研究采用同源序列克隆的方法获得烟草WRKY12基因,序列分析表明,该蛋白属于WRKY家族第2类成员,只有一个WRKY结构域,锌指结构为C-X4-C-X23-H-X1-H。构建系统发育树结果表明,它与大豆中GmWRKY6和GmWRKY12亲缘关系较近,相似性分别达50%和45%。Northern Blot试验证明该基因表达受4℃低温胁迫诱导。将其完整编码区构建到大肠杆菌表达载体,在培养温度18℃条件下添加0.2mmol/L IPTG诱导表达融合蛋白。进一步试验获得特异性和纯度非常高的纯化蛋白和抗体。

“以学生为中心”的教改探索——以植物生物技术课程为例

“以学生为中心”的教学理念,反映了教育学的内在规律,是我国高等教育改革的发展方向。结合植物生物技术课程的特点,阐述了进行“以学生为中心”的教改的必要性,总结了在植物生物技术课程教学实践中贯彻“以学生为中心”理念的具体做法,并提出了相应的建议。

农作物Pht1家族磷转运体蛋白的生物信息学分析

以AtPT1所编码的氨基酸序列做为检索序列,通过对GenBank NR数据库以及EMBI、DDBJ、PDB数据库进行检索,发现小麦、大麦、玉米、水稻和番茄等植物中具全长cDNA的33个Pht1家族磷转运体基因,包括马铃薯1个,苜蓿5个,辣椒3个,茄子2个,烟草2个,番茄2个,菜豆1个,玉米4个,大麦2个,小麦1个,水稻7个,大豆2个和木薯1个。利用生物信息学分析,首次将Pht1家族磷转运体基因保守特征序列确定为GGDYPLSATIMSE。对检索到的33个Pht1家族磷转运体蛋白进化关系分析表明,与AtPT1亲缘关系较近的双子叶植物磷转运体蛋白是木薯MePT1和GmPT2,关系较近的单子叶植物磷转运体蛋白是OsPHT8和OsPHT12。

番茄“美粉1号”子叶再生体系的建立

以番茄品种美粉1号为试验材料,研究20%次氯酸钠和0.1%氯化汞处理不同时间对番茄种子表面消毒和萌发的影响,同时研究不同的激素组合对该品种再生芽形成和生根的影响。结果表明,用20%次氯酸钠对番茄种子消毒20 min,可获得较多的无菌苗;同时发现,IAA浓度为0.2 mg/L和6-BA浓度为2 mg/L组合时,外植体再生芽频率较高,为85.2%,促进不定芽生根的最佳激素浓度为MS培养基中添加0.5 mg/L IAA。再生苗移栽到灭菌处理后的土壤中后成活率较高,可达92%。

布鲁姆教育目标分类法在基因工程课程教学中的应用

基因工程发展迅速,新技术不断涌现,与之对应的教学内容和方法也需要不断更新。文章分析了布鲁姆教育目标分类法的基本内容,并将其理论运用到基因工程的教学当中,对不同知识点进行了教学设计的探索性尝试,同时拓展教学内容和改进教学方法,有利于提高基因工程教学质量及学生的学习与知识运用能力。

农杆菌介导番茄“美粉1号”遗传转化体系优化研究

[目的]优化农杆菌介导番茄"美粉1号"遗传转化体系。[方法]以番茄美粉1号无菌苗的子叶为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化效率进行了优化,建立高效番茄子叶农杆菌介导的遗传转化体系。[结果]外植体在MS+2.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L IAA进行2 d的预培养后,用农杆菌EHA105(浸染浓度为OD=0.4)浸染5 min,转化效率最高;经过PCR检测初步证明nptⅡ基因已整合到番茄再生植株中。[结论]该研究结果为优良基因导入番茄品种美粉1号奠定了基础。

根癌农杆菌介导番茄‘白果强丰’遗传转化体系优化

以番茄无菌苗的子叶为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行了优化,结果表明:外植体在MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LIAA的进行2天的预培养后,用农杆菌EHA105(浸染浓度为OD600=0.6)浸染6min,转化效率最高,经过PCR检测初步证明NPTII基因已整合到番茄再生植株中,本研究建立了高效番茄‘白果强丰’子叶农杆菌介导的遗传转化体系。

农杆菌介导番茄“美粉一号”遗传转化体系优化研究(英文)

[目的]研究农杆菌介导番茄"美粉1号"遗传转化体系的优化。[方法]以番茄美粉1号无菌苗的子叶为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化效率进行了优化,建立高效番茄子叶农杆菌介导的遗传转化体系。[结果]外植体在MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LIAA进行2d的预培养后,用农杆菌EHA105(浸染浓度为OD=0.4)浸染5min,转化效率最高;经过PCR检测初步证明nptⅡ基因已整合到番茄再生植株中。[结论]该研究结果为今后优良基因导入番茄品种美粉1号奠定了基础。

番茄“白果强丰”子叶再生体系的建立

以番茄品种"白果强丰"为试材,研究20%次氯酸钠和0.1%升汞处理不同时间对番茄种子表面消毒和萌发的影响及不同激素组合对该品种再生芽形成和幼苗生根的影响。结果表明:用20%次氯酸钠对番茄种子进行消毒20 min,可获得较多的无菌苗,同时发现,IAA浓度为0.2 mg/L和6-BA浓度为2 mg/L组合时,外植体再生芽频率较高为87.2.2%,促进不定芽生根最佳激素浓度为MS培养基中添加0.5 mg/L IAA。再生苗移栽到灭菌处理后土壤中成活率较高,可达88%。

油菜素内酯合成和信号转导基因在马铃薯块茎贮藏期间的表达变化及对萌芽的影响

为探明油菜素内酯BR在块茎萌芽中的作用,建立更有效的种薯催芽调控体系,选择了休眠期不同的3个品种,利用q RT-PCR分析与BR合成、信号转导、调控有关的9个基因在贮藏期间及抑芽处理下的表达模式;同时检测BR类似物24-表油菜素内酯(24-e BL)及其与赤霉素GA3对块茎萌芽的影响。结果表明,涉及BR合成的4个基因表达量均随贮藏时间延长升高,短休眠品种升高的时间点早于中、长休眠品种;信号转导及调控基因中BRI1和CYCD3的变化与合成基因相似,BSK和TCH4的表达量则在中、长休眠期品种中保持恒定。抑芽处理在贮藏前期能刺激这些基因的表达升高,但之后都迅速下降并保持低水平。转录因子BZR1在各品种中以及抑芽处理下均没有明显变化。24-e BL利于块茎解除休眠,但不促进芽的伸长生长,与GA3互配效果更佳,单株块茎增重37.92%~98.41%。结论表明,BR合成和信号转导是块茎从休眠向萌芽转变的必经生理过程,它与GA3互配用于催芽更利于种薯萌芽的整齐、健壮并促进块茎形成。

烟草NtCBL1基因的克隆、表达载体构建及表达分析

CBL是一类Ca^(2+)感受蛋白,在植物适应或抵制逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。从烟草品种K326中克隆到了一个CBL1的同源基因,该序列包含了一个642 bp的开放阅读框,编码一个由213个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为24.5 kDa,等电点为5.03。同源性分析结果显示,该基因与林烟草CBL1、甜辣椒CBL1等具有较高的同源性,故命名为NtCBL1。生物信息学分析表明,NtCBL1具有CBL家族保守的EF-hand钙结合结构域。组织表达分析发现该基因在成熟期的根、茎、叶、花中均有表达,在根中的表达量最高。逆境胁迫实验表明,该基因表达受低钾、高盐、干旱、ABA和低温诱导调控,参与烟草生物与非生物逆境胁迫的响应。并成功构建了NtCBL1-pBI121过表达载体。研究结果为解析NtCBL1在响应逆境胁迫的功能奠定一定理论基础。

烟草钾离子通道基因NtTPK的克隆及表达分析

采用同源克隆的方法对烟草品种K326中的一个钾离子通道基因NtTPK进行了研究,该基因序列全长1 317 bp,编码438个氨基酸。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在茎中的表达量最高;在低钾处理24 h后该基因表达量最低;200 mmol·L^(-1)NaCl处理24 h后该基因表达量最高;在烟草打顶7 d后,该基因在叶和根中的表达量达到最高。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了一定理论基础。

3种植物生长调节剂对烟草种子萌发的影响

采用GA_3(赤霉素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)3种植物生长调节剂处理烟草种子,研究各生长调节剂对烟草种子发芽的影响。结果表明:经植物生长调节剂处理后的种子发芽动态有所差异,GA_3、6-BA、NAA的一些浓度可以打破种子休眠,加快种子发芽速度,而某些浓度阻碍了种子打破休眠的速度。从种子发芽实验结果来看,3种植物生长调节剂,不同浓度对烟草种子的发芽率有不同的影响,200 mg/L NAA处理的种子发芽率最高,500 mg/L GA3处理的种子发芽率最低;5 mg/L NAA和100 mg/L GA3处理后的种子发芽势最高。从种子发芽指数看,200 mg/L NAA效果最好,500 mg/L GA_3效果最差;从活力指数看,5 mg/L 6-BA效果最佳,50、100 mg/L NAA处理下效果最差。

KCl胁迫对黑麦种子萌发特性的影响

以黑麦为试验材料,研究浓度分别为0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%的KCl溶液对黑麦种子抗盐性的影响。结果表明,在盐胁迫下,随着KCl浓度的增加,黑麦发芽率和发芽势逐渐下降,黑麦的活力指数也成下降趋势。幼苗及胚根生长速度随着KCl浓度增加而减小。

水杨酸通过提高抗氧化酶活性及基因表达缓解番茄低钾胁迫

探讨水杨酸(SA)对低钾胁迫下番茄幼苗生理指标及基因表达的影响,为研究SA和低钾胁迫之间的关系奠定重要的理论基础。研究喷施不同浓度(0.10,0.25,0.50,1.00 mmol/L)的SA对低钾胁迫下番茄幼苗氧化酶活性及基因表达的影响。结果表明,在低钾处理下喷施0.25 mmol/L的SA,番茄幼苗中Chl、Pro的含量、CAT、APX、POD、SOD的活性与对照组相比明显增加,MDA含量则明显降低。同时采用荧光定量PCR对幼苗叶片中的APX、CAT、POD与SOD基因表达模式进行分析,发现这4个基因的表达量在处理48,96 h后明显增加。推测在低钾胁迫下喷施0.25mmol/L SA能促进APX、CAT、POD与SOD基因的表达,进而降低活性氧ROS的积累,增强番茄幼苗对低钾胁迫的抗性。