一株粉状米勒氏酵母的耐受性及所产挥发性风味物质研究

该研究以分离自浓香型白酒酿造环境中的粉状米勒氏酵母(Millerozyma farinose)WLY-Y-91为研究对象,通过对其耐受性能及风味物质代谢情况进行分析,考察该菌在浓香型白酒窖池环境中的适应性,并利用糟醅进行发酵。结果表明,粉状米勒氏酵母WLY-Y-91具有良好的耐受性,可以耐受乙醇体积分数16%、NaCl 200 g/L和葡萄糖1000 g/L,耐受最高温度和最低pH值分别为50℃、pH 2.0。菌株WLY-Y-91的YPD发酵液和五粮粉发酵液中共检出15种相同挥发性风味物质,在五粮粉发酵液中特有的挥发性风味成分有18种,主要为醇、酯类以及乙偶姻;在菌株WLY-Y-91 YPD发酵液中特有的挥发性风味成分有23种,主要为吡嗪类物质。通过实验室水平模拟白酒固态发酵发现,接种菌株WLY-Y-91发酵使粮食糟和丢糟中的残淀和残糖含量分别降低25.50%、76.27%和20.52%、90%,乙酸乙酯、正丙醇及异戊醇含量分别升高143.8%、20.3%、132.1%和44.2%、13.89%、32.67%,说明该菌株可以利用粮食糟和丢糟合成挥发性风味物质乙酸乙酯、正丙醇和异戊醇。这对研究粉状米勒氏酵母在浓香型白酒酿造窖池中的发酵有一定的引导作用。

柔性仿生自动摊晾机对多粮浓香型白酒糟醅特性影响的研究

以浓香型白酒糟醅为研究对象,通过检测柔性仿生自动摊晾机及人工摊晾的糟醅入窖温度、理化性质(水分、酸度、淀粉含量、硬度、粘性等)、感官评价及均匀性等数据,研究自动晾摊机的应用对糟醅性质的影响。结果表明,经自动摊晾机处理后的糟醅温度为25~26℃,相较于人工摊晾的糟醅约高2℃;自动摊晾机处理后的糟醅发酵力为200~260 mg/(g·h),低于人工摊晾后糟醅的发酵力(250~400 mg/(g·h));两种摊晾方式处理后的入窖糟醅水分含量和糖化力基本一致,其中糟醅水分含量约57%、糖化力为13~16 mL/(g·72 h)。此外,两种摊晾方式糟醅的温度、水分、糖化力和发酵力的分布均匀性基本一致。该研究论证了自动摊晾机在浓香型白酒中应用的可能性,为白酒生产的机械化、自动化摊晾提供了参考。

脂肪酶处理白酒丢糟提升复糟酒的品质

本项目以浓香型白酒丢糟为研究对象,研究巴氏灭菌、反应温度、食用酒精添加量、南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)及反应时间等工艺条件对复糟酒酯化效果的影响。实验结果表明,经巴氏灭菌处理后,在食用酒精(95%,V/V)用量为20 mL/100 g丢糟、CALB酶添加量1.5‰(W/W)、20℃下反应3 d,增酯增香的效果最好,乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯及总酯含量依次为3.17 g/L、0.59 g/L、0.76 g/L、4.53 g/L。在此基础上进行1 kg酒糟处理量小试实验,得乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯及总酯含量依次为3.44 g/L、0.85 g/L、0.70 g/L和4.98 g/L,其中浓香型白酒的主要呈香物质乙酸乙酯和己酸乙酯分别较无CALB酶处理实验组提高了16.38倍和16.67倍,且放大前后各酯含量基本保持稳定。本研究为进一步放大实验提供了依据,对脂肪酶催化白酒丢糟资源化再生利用具有重要意义。

脂肪酶酯化白酒黄水的工艺条件优化

本研究以浓香型白酒副产物黄水为研究对象,研究食用酒精(95%,V/V)添加量、反应温度及南极假丝酵母展示脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B,CALB)添加量等工艺条件对黄水酯化效果的影响,并对产物的精制工艺进行探讨。单因素实验及响应面优化结果表明,在食用酒精用量为52.5%(V/V)、CALB酶添加量5.32%(W/V)、31.5℃下反应48 h,增酯增香的效果最佳,乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯及总酯含量依次为1.81 g/L、6.09 g/L、14.49 g/L、22.39 g/L,白酒风味酯浓度提升了31.9倍;且酵母展示CALB酶重复使用10次转化率保持不变。黄水酯化反应产物蒸馏、萃取可得白酒呈香物质混合液,总酯回收率为76.56%。本研究可利用黄水生产天然等同香料及白酒调酒液等功能性酯化液,经优化后的工艺条件温和、反应周期短且酯含量提升明显,易于放大和工业化生产,对黄水资源再生利用具有重大意义。

促进米黑根毛霉脂肪酶分泌的毕赤酵母内源信号肽的筛选

米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase,RML)在造纸、食品、化妆品以及医药等行业应用广泛。本研究通过SignalP 4.1在线预测软件预测出9种具有分泌潜力的毕赤酵母内源信号肽序列:FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9。以广泛应用的酿酒酵母α-交配因子(α-mating factor,α-MF)信号肽为对照,考察这九种内源信号肽对增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)和RML在蛋白酶缺陷型PichiaPinkTM表达系统的分泌效果。结果发现FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介导EGFP分泌,且PRY2、DSE4、MSB2、FRE2介导EGFP的分泌水平优于α-MF,分别是α-MF的2.15倍、1.15倍、1.33倍、1.30倍;FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介导RML的分泌,且FLO10介导RML的分泌水平最高,是α-MF的1.50倍,说明内源信号肽FLO10更能有效分泌RML。本研究为提高米黑根毛霉脂肪酶在蛋白酶缺陷型毕赤酵母的表达量奠定了一定的基础。

分子伴侣共表达对核糖核酸酶R可溶性表达的影响

核糖核酸外切酶R(RNase R)可降解几乎所有的线性RNA分子和Y结构RNA,但不易降解环形RNA(circ RNA)、套索结构(lariatRNA)和3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子,因此可以构建内含子c DNA文库用于可变剪切研究。本研究构建了含rnr基因的重组表达质粒pET-22b(+)-rnr,并将其表达产物纯化后通过SDS-PAGE分析和酶活性评价,确认rnr基因在大肠杆菌中已实现表达。之后构建4种分子伴侣共表达系统(pGro7、pKJE7、pTf16和pG-Tf2)。4种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pET-22b(+)-rnr共表达,筛选最适分子伴侣质粒,并优化共表达条件,提高目的蛋白可溶性表达。实验表明,分子伴侣质粒pGro7使蛋白表达量提高了43.80%,效果最为显著;20℃诱导时目的蛋白的可溶性表达最高;当L-阿拉伯糖浓度为0.50 mg/mL时,分子伴侣质粒pGro7使蛋白表达量提高了54.50%。通过使用分子伴侣共表达系统及优化表达条件提高了RNase R的可溶性表达,为该酶进一步研究奠定了基础。