基于高通量测序和小分子核苷类似物诊断与治疗猫传染性腹膜炎病例转归

猫传染性腹膜炎(简称猫传腹)是一类由冠状病毒引起、以严重腹腔炎症为特征的高致死性传染病,然而对其病原的诊断尚无公认的标准方法,且无有效的治疗手段可应用于兽医临床。因此,本研究通过描述一例猫传染性腹膜炎病例诊治过程,探索针对该病的合理诊疗手段。本研究利用高通量测序技术,综合临床症状、生化分析、血常规等检测方法,实现对该病例的诊断,基于白/球蛋白比、fSAA等临床指标评估抗病毒药物GS-441524治疗效果,监控转归进程。结果表明高通量测序技术可应用于猫传腹的诊断过程,经高剂量药物治疗后临床症状明显改善,8周白/球蛋白比、fSAA两项特征指标恢复正常,10周符合出院标准,16周复查未见疾病复发迹象。此病例的成功治疗证明高通量测序技术在兽医临床诊断的应用价值和GS-441524药物对危重病例治疗的有效性,血清白/球蛋白比(≥0.6)和fSAA(<5μg·mL^(-1))可作为临床指标评估治疗效果。

非侵入性血流检测法辅助卒中后抑郁模型的建立

卒中后抑郁是脑卒中患者发病率最高的精神障碍性疾病,其发病机制复杂,缺乏有效治疗性药物。为了建立更高效的小鼠动物模型,以研究该病发生机制、评估药物疗效,通过改良手术方案,并用激光散斑血流成像系统对造模试验进行非侵入性血流检测法辅助构建卒中后抑郁小鼠模型。结果表明,该方法可在造模过程中,实时、准确判断给药位置及药物作用效果,经过蔗糖偏好试验、悬尾试验等行为学检测方法,证明激光散斑血流成像系统辅助方法能够有效监控手术过程,提升卒中后抑郁Balb/c小鼠模型建立的成功率。

猪肠道α冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪肠道α冠状病毒(SeACoV)荧光定量检测方法,本研究采用RT-PCR方法扩增SeACoV N基因保守区序列,将其克隆至p EASY-Blunt载体,构建重组质粒p EASY-Blunt-PA-N作为标准阳性质粒,以其为模板建立SeACoV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验验证。结果显示,建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 Ct值与标准品模板在9.47×101拷贝/μL～9.47×107拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.91。本实验建立的方法对PEDV、TGEV、PDCo V、PRRSV等猪常见腹泻病样品检测无扩增,表明特异性良好;敏感性试验结果显示,该方法检测下限可达到9.47×101拷贝/μL;重复性试验结果显示,组内变异系数在0.82%～1.01%,组间变异系数在1.20%～1.69%,重复性较好。采用本研究建立的方法对广西和云南等地70份临床样品进行检测,结果显示除阳性对照外,临床样品均为阴性,表明该病毒尚未传播至广东以外的省份。本实验首次建立了SeACoV N基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,为SeACoV快速检测和病毒感染预防提供技术手段。

PDCoV和PEAV二重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻症状为主,症状相似,临床上难以快速诊断。为建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法,本研究根据PDCoV和PEAV N基因序列,分别设计2对特异性引物,以阳性质粒为模板,对二重RT-PCR反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性试验。结果显示,所建立的方法能够扩增出PDCoV和PEAV的特异性片段,大小分别为690 bp和208 bp,且对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)无扩增条带;对PDCoV和PEAV的最低检测量分别为5.13×102copies/μL、4.73×101copies/μL。对60份临床腹泻样本病料进行检测,结果PDCoV的检出率为21.6%,未检测出PEAV。本研究所建立的二重RT-PCR方法可用于临床流行病学监测,为快速诊断PDCoV和PEAV提供理论依据和技术支持。

5/7型猪细小病毒双重PCR检测方法的建立

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起猪呼吸和繁殖障碍的重要病原体,感染比例逐年上升,现有PPV5和PPV7的检测效率低,故建立针对PPV5/7的多重检测方法,可增加样品利用率,提高检测效率。本研究根据2种病原的保守序列,设计特异性引物,通过对反应条件和体系优化,建立快速检测PPV5和PPV7双重PCR方法,并对该方法的灵敏性、特异性进行验证。结果显示,建立的双重PCR方法仅对PPV5、PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猫细小病毒(FPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的核酸均无特异性扩增;对病原核酸混合模板的检出下限为10拷贝/μL,与单一PCR检测结果一致。本研究建立一种特异性强、敏感性高的多型PPV双重检测方法,为调查PPV5和PPV7在猪群中的感染情况提供快速检测方法。