BDNF重组腺病毒的构建及在大鼠骨髓间质干细胞的表达

目的 :利用大肠杆菌细菌内同源重组构建带有增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因的脑源性神经营养因子前体 (proBDNF)和脑源性神经营养因子 (BDNF)重组腺病毒并在大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC)高效表达。方法 :采用两步亚克隆的方法将proBDNF和BDNF构建入带有EGFP表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV中 ,形成转移载体pAdTrack -proBDNF和pAdTrack -BDNF ,采用化学转化法在大肠杆菌BJ5 183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy- 1同源重组 ,得到重组腺病毒载体pAd -proBDNF和pAd -BDNF ;转染 2 93细胞 ,包装成重组病毒颗粒 ;将重组病毒上清感染rMSC ,用荧光显微镜下观察和Western -blotting鉴定重组病毒在rMSC表达 ;用Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC在体外诱导向神经样细胞分化 ;用Ad -proBDNF和Ad -BDNF的感染的rMSC接种于裸鼠肌肉内 ,两周后荧光显微镜下直接观察。结果 :成功地构建了proBDNF和BDNF重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒 ,重组病毒能在体外培养的rMSC高效表达并不影响其分化潜能 ,体内移植实验表明Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC能在体内表达。结论 :重组腺病毒具有较高的介导proBDNF和BDNF基因表达于rMSC的效率 ,带有报告基因EGFP的Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC可以用于体内移植实验。

腺病毒介导的EGFP基因在大鼠骨髓间质干细胞中的高效表达

目的 :研究复制缺陷型腺病毒感染骨髓间质干细胞介导外源基因表达的可行性及感染效率。方法 :在体外低密度扩增大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC) ,用细菌同源重组法构建巨细胞病毒 (CMV)驱动的增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因腺病毒载体 (pAd -EGFP) ,用 2 93包装细胞制备腺病毒 ,用EGFP重组腺病毒感染rMSC ,观察重组腺病毒携带基因在MSC中的感染和表达情况 ,用细胞计数法和流式细胞仪分析感染效率。用血清撤离加入 β -巯基乙醇诱导Ad -EGFP感染的rMSC向神经样细胞定向分化。结果 :Ad -EGFP可高效感染rMSC ,感染率为 (3 6±2 ) % ,而脂质体法转染质粒pTrack -GFP在rMSC转染效率非常低且不易成功 ;Ad -EGFP感染后的不同扩增代数的rMSC在受到 β -巯基乙醇的诱导分化后在荧光显微镜下呈典型的突触形式。免疫组化鉴定发现这些诱导细胞表达神经元特异烯醇化酶 (NSE) ,表明腺病毒介导外源基因转染后rMSC仍具有分化为神经样细胞的潜能。结论 :腺病毒载体具有较高的介导外源基因表达于rMSC的效率 。

应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒

目的 :利用大肠杆菌细菌同源重组构建重组腺病毒载体并在 2 93细胞制备高滴度重组病毒。方法 :自细胞周期相关激酶真核表达载体pCR3 1 -CCRK中酶切出CCRK基因 ,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV中 ,形成转移质粒pAdTrack -CMV -CCRK ,采用电穿孔或化学转化法在大肠杆菌BJ51 83内与腺病毒骨架质粒pAdEasy - 1同源重组 ,得到重组腺病毒载体pAd -CCRK。以pAd -CCRK为模板 ,经DNA测序正确后 ,用PacI酶切线性化pAd -CCRK ,转染 2 93细胞 ,包装成重组病毒颗粒 ,荧光显微镜观察转染细胞EGFP的表达 ,采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。将重组病毒上清感染RAW细胞 ,荧光显微镜下观察感染细胞重组病毒的表达。结果 :成功地构建了携带CCRK基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒 ,重组病毒能在体外高效表达。结论 :应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体 ,可高效制备均一的高滴度重组病毒 。

成年大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

目的 探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞（ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｒＭＳＣｓ）的体外 增殖和特异性诱导分化为神经元样细胞的能力。方法 分别采用３种不同的诱导方法体外定向诱导第三至五代的 ｒＭＳＣｓ向神经元样细胞分化，并分别应用相差显微镜观察神经元样细胞和免疫细胞组化检测神经元样细胞所表达 的神经元特异性标志［神经元特异性烯醇化酶（ｎｅｕｒｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ，ＮＳＥ）和神经丝蛋白（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ，ＮＦ）］及 星形胶质细胞特异性标志［胶质纤维酸性蛋白（ｇｌｉａ ｆｉｂｅｒ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）］，并进行神经元样细胞定量分析。结 果 所采用的３种定向诱导方法都能使ｒＭＳＣｓ特异性诱导分化为神经元样细胞，此神经元样细胞都能特异性地表 达出ＮＳＥ和ＮＦ，而不表达ＧＦＡＰ。经过定量计数分析发现用上述方法处理ｒＭＳＣｓ后出现ＮＳＥ阳性的细胞约为 ７５．５％±３．５％，出现ＮＦ阳性的细胞约为７７．２％±２．８％。结论ｒＭＳＣｓ能在体外扩增、传代，并能被定向诱导分 化为神经元样细胞。

带Tat标记质粒载体的构建及其转导融合蛋白进入细胞的研究

采用点突变技术构建了带 6×His、Tat和Flag多个标记的pET HTF的质粒载体 ,利用基因重组技术构建pET HTF EGFP融合蛋白载体 .酶切和DNA测序证明 ,所构建的pET HTF和pET HTF EGFP载体正确 .BL2 1(DE3)表达融合蛋白 ,用Ni2 + 分离柱纯化His Tat Flag EGFP蛋白 ,并加入培养的NIH3T3细胞 .荧光显微镜观察显示 ,His Tat Flag EGFP融合蛋白进入细胞 .带His、Tat和Flag标记的质粒载体pET 14b HTF表达的融合蛋白能够进入细胞 。

供者源性的骨髓间质干细胞对急性移植物抗宿主病的影响

目的 :采用大鼠骨髓移植模型探讨共移植供者源性的骨髓间质干细胞 (MSCs)对骨髓移植后急性移植物抗宿主病 (GVHD)的影响。方法 :体外培养Fisher344大鼠骨髓间质干细胞 ,扩增至第 5代用于移植。建立大鼠异基因急性GVHD模型 (F344→Wistar)。受者Wistar大鼠采用致死性全身照射预处理 ,当天移植F344大鼠骨髓细胞和脾细胞。实验组则移植F344大鼠骨髓细胞、脾细胞和第 5代的MSCs。观察各组移植后急性GVHD的发生时间、发病率和存活时间。结果 :共移植MSCs推迟急性GVHD的发病时间 [( 19 1± 1 7)dvs( 15 6± 1 5 )d ,P <0 0 5 ],延长该组的存活时间 [( 35 6± 7 0 )dvs ( 2 5 4± 6 0 )d ,P <0 0 5 ],但无法完全消除急性GVHD的发生。结论 :MSCs在体内具有免疫抑制功能 ,供者来源的MSCs在不使用免疫抑制剂情况下 。

载脂蛋白E多态性与脑梗死及脂类代谢关系的研究

目的 :探讨载脂蛋白E(ApoE)多态性与脑梗死及脂类代谢的关系。方法 :缺血性脑梗死组 110例 ,健康对照组 6 0例。ApoE表型采用等电聚焦 (IEF)电泳及免疫印迹 (Westernblotting)技术测定 ,血清总胆固醇 (TC)、甘油三酯 (TG)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL -C)采用酶法测定 ,低密度脂蛋白胆固醇 (LDL -C)按Fridwald公式计算 ,ApoAⅠ、ApoB用火箭电泳法测定 ,ApoE、脂蛋白 (a) [Lp(a) ]用ELISA法测定。结果 :脑梗死组ApoEε4等位基因表达显著高于对照组 (P <0 0 5 ) ;脑梗死组TC、TG、LDL -C、ApoB、ApoE、Lp(a)水平显著高于对照组 (P <0 0 5或P <0 0 1) ,ApoAⅠ、HDL -C显著低于对照组 (P <0 0 5 ) ;脑梗死组各等位基因 (ε2、ε3、ε4 )之间血脂水平比较 ;含ε4等位基因者 ,TC、LDL -C、ApoB、Lp(a)水平高于含ε3者 (P <0 0 5 ) ,HDL -C、ApoAⅠ较低 (P <0 0 5 ) ;含ε2等位基因者 ,TG、HDL -C、ApoAⅠ、ApoE高于含ε3者 (P <0 0 5 ) ,TC、LDL -C、ApoB较低 (P <0 0 5 )。结论 :ApoEε4等位基因与脑梗死发病有关 ,ε2。

人eNOS启动子不同序列驱动的红色荧光蛋白载体的构建与表达

目的 :为了研究人血管内皮细胞一氧化氮合酶 (eNOS)启动子的功能 ,构建在哺乳动物细胞中表达的人eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体。方法 :从重组pDseNOSRed载体上将eNOS启动子的不同长度DNA序列亚克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1 - 1上 ,经PCR、酶切和DNA测序鉴定 ,将重组载体pDsF1 0 33Red ,pDsF494Red和pDsF1 66Red转染NIH3T3细胞 ,在倒置荧光显微镜下观察它们在细胞内的表达情况。结果 :PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDsF1 0 33Red ,pDsF494Red和pDsF1 66Red的构建正确 ,这些载体能在NIH3T3细胞中有效表达。由eNOS启动子不同区段驱动表达的 95 %以上的红色荧光蛋白均匀分布于整个细胞 ,转染后 48- 60h开始出现 ,96 - 1 4 4h为红色荧光蛋白 (RFP)的表达高峰 ,RFP的荧光在 1 4 4h最强 ,1 68h后红色荧光逐渐消退 ,2 1d后仍有很少量红色荧光残留。RFP的表达量和荧光强度明显低于强启动子pCMVIE驱动的RFP。结论 :成功构建了eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体 ,它们能在哺乳动物细胞中有效表达 ,静息状态下呈现弱转录活性 。

载脂蛋白E基因变异与视网膜色素变性关系的研究

目的通过检测中国汉族人视网膜色素变性患者的载脂蛋白Ｅ表型，探讨其基因变异与视网膜色素变性发病的关系。方法采用等电聚焦及免疫印迹方法检测正常人和视网膜色素变性患者的ａｏｐＥ表型。结果视网膜色素变性患者中ε４基因频率明显上升（χ２＝１２．９８３，Ｐ＜０．０１），ε２，ε３基因频率与正常对照组无差异。ａｏｐＥ ε４等位基因与视网膜色素变性的发病有关联（ＲＲ＝２５．０７１，Ｐ＜０．０１）。结论ａｏｐＥ ε４基因可能是视网膜色素变性发病的又一遗传因素。

信号肽-FRET荧光蛋白载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的构建带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白(pECFP-C1-SP)和增强型黄色荧光蛋白(pEYFP-C1-SP)的质粒载体,为使用荧光共振能量转移(FRET)技术研究LPS在细胞膜上的受体识别机制提供依据。方法采用点突变技术构建了带TLR4信号肽的载体,用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞,观察带信号肽载体和融合蛋白载体在细胞内的表达。结果DNA测序证明所构建的带TLR4信号肽的载体正确;酶切和DNA测序表明融合蛋白载体的构建正确,TLR4信号肽可以使蛋白主要表达在膜上。结论所构建的带信号肽的荧光蛋白载体是正确的,pECFP-C1-SP和pEYFP-C1-SP能够表达在细胞膜上,可有效地应用于膜蛋白相互作用的研究。

载脂蛋白E在正常和病变肝组织中的表达

目的：探讨载脂蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ） 在正常和病变肝组织中的免疫定位分布。方法：应用免疫组化ＳＰ法分别检测正常和病变肝组织ＡｐｏＥ的表达，正常肝组织１２ 例（ 正常肝组织３ 例，癌旁正常肝组织９ 例） ，病毒性肝炎６ 例，肝硬化２２ 例，肝癌３０ 例（Ⅰ级Ⅱ级１３ 例，Ⅲ级Ⅳ级１７ 例） ，肝母细胞癌６ 例，肝海绵状血管瘤４ 例。结果：ＡｐｏＥ 在正常肝细胞广泛表达，为胞浆表达，在临近肝窦一面的肝细胞为胞膜表达，Ｋｕｐｆｆｅｒ 细胞表达阳性，肝内胆管上皮和肝血管内皮细胞不表达；在肝炎、肝硬化、分化较好的肝癌（Ⅰ、Ⅱ级） 表达，在分化较差的肝癌、肝母细胞瘤不表达。

应用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单克隆抗体

目的：纯化单克隆抗体（ 单抗，ＭｃＡｂ） 。方法：应用Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ制备免疫亲和层析柱，纯化载脂蛋白（Ａｐｏ）Ｅ４、ＡｐｏＥ６、抑制素（ｉｎｈｉｂｉｎＩＮＨ）α、βＡ、βＢ５ 种ＭｃＡｂ。结果：ＭｃＡｂ 纯化后电泳呈一条带，并有较好的免疫活性。结论：应用蛋白Ａ亲和层析法可以纯化ＭｃＡｂ。

人eNOS启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体构建与表达

目的研究血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)启动子的功能和eNOS基因表达的调控机制 ,利用红色荧光蛋白构建在哺乳动物细胞中表达的人eNOS启动子全长及其不同区段DNA序列驱动的红色荧光蛋白报告基因载体 ,并对它们在哺乳动物细胞的表达规律作了观察。方法从人脐静脉内皮细胞基因组DNA中克隆eNOS启动子全长( -1～ -1600bp)基因序列(GenBandTM,AccessionNumbe:AF387340)将其构建到红色荧光蛋白载体pDsRed1 -1上 ,经PCR、酶切和DNA测序鉴定正确后命名为pDse_NOSRed。然后以重组pDseNOSRed载体为模板 ,通过DNA序列删除法将eNOS启动子的不同区段DNA序列亚克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1 -1上。这些区段分别是F1033 ,主要删除AP1( -1524～ -1530)、SRE1( -1379～ -1385)和AP2( -1155～ -1163)元件 ;F494 ,主要删除SSRE( -994～ -1000)、AP1( -656～ -662)和RCE( -857～ -863,-812～ -817 ,-711～ -716)元件 ;F166 ,主要删除CACCC( -366～ -370)和GATA( -226～ -231)元件 ,并保留SP1( -95～ -104)元件。所用上游引物分别为5' -gaagatctatctgatgctgcctgtcaccttgaccctgag-3',5'-ccagatctccgtttctttcttaaact_3'、5'_cgagatctgaggtgaaggagagaac_3'和5'_caagatctgtggagctgaggcttt_3',均含有Bg1Ⅱ酶切位点(黑体和下线所?

载脂蛋白E与视网膜疾病关系的研究

目的 :通过检测中国汉族人视网膜色素变性患者的载脂蛋白E表型及孔源性视网膜脱离病人视网膜下液(SRF)及血液中载脂蛋白E(apoE)的含量 ,探讨载脂蛋白E与视网膜疾病的关系。方法 :采用等电聚焦及免疫印迹方法检测正常人和视网膜色素变性患者的aopE表型及ELISA方法测定孔源性视网膜脱离病人视网膜下液(SRF)及血液中载脂蛋白E(apoE)的含量。结果 :aopE的ε4 等位基因与视网膜色素变性的发病有关联 (RR =2 5 0 71P <0 0 1)。SRF中apoE的含量与视网膜脱离的范围及时间相关 (P <0 0 1)。结论 :aopE的ε4 基因可能是视网膜色素变性发病的又一遗传因素 ;

抑制素α、βA、βB亚基在乳腺和生殖系统肿瘤组织中的表达

目的：抑制素（ＩＮＨ） 单克隆抗体α、βＡ、βＢ亚基在生殖系统肿瘤组织中的免疫组化定位研究，并探讨ＩＮＨ与乳腺癌的关系。方法：应用免疫组化ＳＰ法，检测４ 例卵巢颗粒细胞瘤、４ 例睾丸支持细胞瘤，５ 例睾丸精原细胞瘤及４０ 例乳腺浸润性导管癌ＩＮＨα、βＡ、βＢ各亚基的表达。结果：卵巢颗粒细胞瘤、睾丸支持细胞瘤，睾丸精原细胞瘤各亚基皆呈阳性反应。４０ 例乳腺癌浸润性导管癌中ＩＮＨα、βＡ、βＢ阳性率分别为７２．５％ ，７７．５％ 和７０．０ ％ ，各亚基阳性率无明显差异（ Ｐ＞ ０．０５） 。结论：ＩＮＨ除在生殖细胞中阳性表达外，在乳腺癌表达阳性率超过７０ ％ 。

白血病患者骨髓细胞中载脂蛋白E的表达

目的：探讨白血病患者骨髓细胞中载脂蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ） 的表达。方法：应用免疫组化ＳＰ法检测正常人骨髓细胞及白血病患者骨髓细胞ＡｐｏＥ的表达，正常人骨髓涂片６ 例，急性淋巴细胞性白血病１３ 例，急性髓性细胞白血病２９ 例。结果：ＡｐｏＥ在所检正常人骨髓涂片中均表达（ 着色程度＋ ～《） ，骨髓细胞表达阳性率为２０％ ±４％ 。急性淋巴细胞白血病原始细胞中不表达ＡｐｏＥ，急性髓性细胞白血病原始细胞不同程度表达ＡｐｏＥ，其中急性粒细胞白血病部分分化型着色＋ ，原始细胞表达阳性率为７０％ ±３２ ％ ，急性早幼粒细胞白血病着色《～》，阳性率８９％ ±４ ％ ，急性粒单细胞白血病着色（＋ ～《），阳性率５０％ ±３％ ，急性单核细胞白血病着色《，阳性率１５ ％ ±４ ％ 。

人抑制素βB亚基单克隆抗体的制备和鉴定

目的：人抑制素βＢ亚基单克隆抗体（单抗）的制备和鉴定。方法：以化学合成人抑制素βＢ（１－ ２８） 和（８５－１１５）多肽片段和粗提猪卵泡抑制素免疫ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠，经细胞融合与筛选，得到分泌单抗的细胞株，诱生腹水后采用特定的免疫学方法进行鉴定。结果：获得４ 株能分泌单抗的细胞株，ＥＬＩＳＡ 检测腹水效价为１ ×１０－４ ～１ ×１０－ ６，与α、βＡ亚基片段及其他多肽激素无交叉反应，３ 株ＭｃＡｂ（ 抗ＩＮＨβＢ（８５－ １１５）） 识别同一抗原位点。相对亲和力３Ｅ８＞５Ｅ１１＞７Ｂ９。腹水中的抗体能明显地被人卵泡液，猪卵泡液和βＢ（８５ －１１５）ＢＳＡ 中和而呈抑制曲线。

多学科协作护理的教学查房模式在手足外科临床教学中的应用效果

研究在手足外科临床教学中,采用多学科合作护理的教学查房模式的效果。方法 从2021年7月到2022年12月,对60名手足外科实习生进行了电脑随机分组研究。实习生中,包括30名观察组和30名对照组。观察组实习生接受多学科合作护理的教学查房模式,对照组实习生接受传统的单一学科教学查房模式。比较两组实习生的相关指标。结果 在理论考试成绩优秀率方面对照中,与对照组相比,观察组显著较高(P<0.05)。同时,在各项临床技能成绩评分方面对照中,观察组也显著较高(P<0.05)。在实习生的满意程度对照中,与对照组实习生相比,观察组更高(P<0.05)。结论 为了提升手足外科临床教学效果,选择应用多学科合作护理的教学查房模式具有明显效果,实习生在改善理论成绩与实践技能方面具有积极效果,且实习生对本次研究满意度评价较好。