栉孔扇贝EST-SNP标记开发及多态性分析

EST(表达序列标签)数据库发掘是单核苷酸多态性标记(SNP)开发的重要途径。本研究利用栉孔扇贝转录组测序数据进行SNP筛选,在含有4条EST以上的18 780条contig(拼接序列)中,共获得21 813个候选SNP位点。利用高分辨率熔解曲线结合非标记探针技术,对其中90个位点在4个野生群体中进行了位点多态性检测。得到33个(36.7%)具有二等位基因位点,并对其中26个位点进行了功能注释。进一步的标记验证显示,33个多态位点在青岛野生群体的48个个体中均成功分型,其观测杂合度Ho和期望杂合度He的分布范围分别为0.062 5～0.744 7和0.099 8～0.504 6,其中5个位点偏离Hardy-Weinberg平衡,各位点间没有检测到连锁不平衡。研究为栉孔扇贝群体遗传学和遗传育种分析提供了候选标记。

富集文库—菌落原位杂交法筛选栉孔扇贝的微卫星标记

应用微卫星富集文库——菌落原位杂交法，筛选得到了40个栉孔扇贝的微卫星标记。用固定了（AG）15和（AC）15探针的尼龙膜（HybondN^＋）捕捉含有微卫星DNA的片段，经洗脱、PCR扩增和TA克隆，构建栉孔扇贝的微卫星富集文库。利用ECL试剂盒（Amersham公司）标记的（AG）15和（AC）15探针进行菌落原位杂交筛选微卫星富集文库，阳性克隆经测序获得微卫星DNA。富集文库中1200个重组克隆经过菌落原位杂交后，532个（44．3％）为阳性克隆。任意挑选100个克隆测序，结果显示所有的克隆都至少含有一个微卫星位点。利用软件设计了65对特异性PCR引物，40对能扩增出清晰的带谱；利用48个栉孔扇贝个体评价微卫星位点，分析表明37个位点具有多态性。不同的位点获得的等位基因数目为2～14个不等，37个多态性位点共获得258个等位基因，平均每个位点获得7．0个等位基因。观测杂合度（H0）、期望杂合度（HP）及多态性信息含量值（P配）的范围分别为0．1000-1．0000、0．1197-0．9831和0．1172-0．9782。结果表明，富集文库一菌落原位杂交法适合大规模筛选目标物种的微卫星标记。

栉孔扇贝转录组来源单核苷酸多态性位点的多态性分析

应用高分辨率熔解曲线技术对栉孔扇贝转录组来源的单核苷酸多态性位点进行验证分型和多态性分析。根据栉孔扇贝转录组单核苷酸多态性位点序列信息,对其中150个位点设计引物和探针,在4个栉孔扇贝野生群体中进行验证分型。其中,103对引物扩增出目的产物,76个位点成功分型,58个多态位点中51个是二等位多态性单核苷酸多态性(34.0%)。进一步在荣成野生群体中对51个二态单核苷酸多态性位点进行多态性验证和群体遗传学分析,其中49个位点呈现多态性,且均为二态,最小等位基因频率为0.0610～0.5000,观测杂合度和期望杂合度分别为0.0833～0.8889和0.0833～0.5833。经Boferroni校正,有2个位点(C1630S115_AG和C19848S286_CA)在该群体中偏离Hardy-Weinberg平衡。各位点之间未检测到连锁不平衡。这些多态单核苷酸多态性位点可用于栉孔扇贝连锁图谱构建、分子标记辅助育种以及数量性状的基因定位等遗传学研究。