NVP-BEZ235逆转伯基特淋巴瘤RAJI细胞阿霉素耐药的研究

目的:研究NVP-BEZ23对耐阿霉素细胞株RAJI/DOX的逆转耐药作用。方法:利用浓度梯度法诱导耐阿霉素细胞株RAJI/DOX;Western blot测定各组细胞Pgp、p-AKT、p-mTOR蛋白水平;MTT法检测细胞抑制率,SPSS软件测定IC50。结果:成功诱导出耐阿霉素细胞株RAJI/DOX。耐阿霉素细胞株RAJI/DOX中Pgp、p-AKT、p-mTOR蛋白水平高于亲本细胞RAJI。NVP-BEZ235可引起耐阿霉素细胞株RAJI/DOX中p-AKT、p-mTOR蛋白水平下降。NVP-BEZ235能够抑制耐阿霉素细胞株RAJI/DOX增殖,与阿霉素具有协同作用。结论:PI3K/AKT/mTOR通道在耐阿霉素伯基特淋巴瘤细胞中进一步活化;NVP-BEZ235通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通道活化,能够与阿霉素协同抑制伯基特淋巴瘤耐药细胞,逆转伯基特淋巴瘤耐药细胞对阿霉素的耐药性。

抗原致敏、GM-CSF基因修饰的树突状细胞诱导免疫杀伤多发性骨髓瘤细胞U266的研究

本研究探讨负载有多发性骨髓瘤细胞U266可溶性抗原并携带外源基因粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的树突状细胞(DC),在体外激活自身T淋巴细胞形成细胞毒T淋巴细胞(CTLs)对U266细胞的杀伤作用。用U266可溶性抗原致敏DC,再用含有外源基因GM-CSF的腺病毒感染DC,将所得的DC与T细胞混合培养以形成对U266具有特异杀伤作用的CTL,最后通过测定乳酸脱氢酶(LDH)以计算CTL对U266的杀伤率。结果表明:负载抗原及外源基因组、负载抗原组和对照组之间的杀伤率存在显著差异(n=3,F=10.939,p<0.05);两两比较表明,负载抗原及外源基因组的杀伤率高于其它两组(p<0.001),且负载抗原组高于对照组(p<0.001)。结论:以U266可溶性抗原致敏的DC可诱导出对U266具有特异杀伤作用的CTL,当所致敏的DC通过腺病毒感染而带有外源基因GM-CSF时,所诱导的细胞毒杀伤反应则进一步增强。

PI3K/Akt/mTOR信号传导通路在套细胞淋巴瘤中的活化情况

目的检测PI3K/Akt/m TOR信号传导通路传导分子PI3K、Akt、m TOR下游信号分子磷酸化情况,评估该通道活化情况,探讨套细胞淋巴瘤(MCL)发病机制。方法选择医院病理科2005~2015年MCL石蜡包埋标本15例(MCL组)和淋巴结反应性增生(LRH)20例(LRH组)。应用免疫组织化学技术检测2组p-Akt、p-m TOR、p-RPS6的表达水平。结果 MCL组p-Akt、p-m TOR、p-RPS6的阳性表达率均高于LRH组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PI3K/Akt/m TOR信号通路在MCL中异常活化,该通路异常表达可能与MCL的发病机制有关。

特发性血小板减少性紫癜的抗幽门螺杆菌治疗

特发性血小板减少性紫癫（ITP）是以出血及外周血血小板减少、骨髓巨核细胞数正常或增多伴有成熟障碍为主要表现的疾病。ITP患者体内产生血小板自身抗体与血小板膜糖蛋白（GPs）结合后,使得血小板在网状内皮系统（RES）被大量破坏,而形成出血症状。

稳定沉默钙网蛋白表达通过下调VEGF、MMP2/9的表达抑制SNK6细胞侵袭能力

目的:探索稳定下调钙网蛋白(calreticulin,CALR)对NK/T细胞淋巴瘤细胞SNK6细胞侵袭性的影响及其可能机制。方法:设计靶向人钙网蛋白的特异性短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列,构建重组慢病毒载体;三质粒系统包装慢病毒颗粒,感染SNK6细胞,嘌呤霉素抗性筛选稳定下调钙网蛋白表白的SNK6细胞。应用CCK8法测定细胞增殖活力,Transwell小室测定细胞侵袭。Western blot检测SNK6细胞CALR表达水平,荧光定量PCR检测SNK6细胞CALR、MMP2、MMP9和VEGF的转录水平。结果:成功构建重组慢病毒载体pLKO.1-puro-shCALR,并包装慢病毒,筛选出稳定下调钙网蛋白的SNK6细胞株。稳定下调SNK6细胞钙网蛋白表达后,SNK6侵袭性减弱,MMP2、MMP9和VEGF的转录水平降低。结论:稳定下调SNK6细胞钙网蛋白的表达可使SNK6细胞侵袭性减弱,其机制可能与降低MMP2、MMP9和VEGF的转录水平有关。

用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应

本研究探讨转染survivin(SVV)基因的树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应。对人外周血DC进行诱导培养,以Ad-SVV转染DC,用Westernblot鉴定Survivin的表达,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,用混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,以ELISA法检测上清中的细胞因子IL-12含量。结果表明:在MLR中,刺激应答比(S/R)为1∶5、1∶10、1∶50和1∶100时,转染Ad-SVV的DC有较强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;转染Ad-SVV的DC组所诱发的CTL活性明显高于对照DC组;转染病毒后第2天,转染Ad-SVV的DC组的IL-12分泌水平高于对照DC组。结论:含存活蛋白基因的DC能够在体外诱导特异性CTL效应,对CA46细胞有明显的杀伤作用。

弥漫性大B细胞淋巴瘤预后相关因素的初步探讨

目的：探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的临床病理因素以及Ki-67、Bcl-2与疗效和预后的关系。方法：选择首诊弥漫性大B细胞淋巴瘤病例，并收集其病理本总共41例。检测Ki-67和Bcl-2在DLBCL病理标本当中的表达，探讨Ki-67和Bcl-2两者的相互关系，分析常见临床病理因素与Ki-67和Bcl-2之间的关系，探讨患者的总生存率与这些临床病理因素和免疫组化指标之间的相互关系。结果：Ki-67和Bcl-2两者在DLBCL患者病理标本中的表达呈负相关。DLBCL患者中，Bcl-2的表达与临床分期、IPI评分有关；Ki-67的表达与LDH水平有关。DLBCL患者的近期疗效与年龄、临床分期、IPI评分、Bcl-2表达等有关。DLBCL患者的预后与患者的临床分期、IPI评分、Ki-67表达、Bcl-2表达以及近期疗效等因素有关。结论：Ki-67和Bcl-2可作为判断DLBCL患者预后的指标，也可以用来指导临床治疗工作。DLBCL患者若有Bcl-2阳性、年龄＞60岁、临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、IPI评分≥2分等因素则提示近期疗效不佳。而Ki-67阳性、Bcl-2阳性、临床分期、IPI评分和近期疗效等是DLBCL患者的独立预后因素。

胃癌患者凝血功能、D二聚体、血小板计数的变化与肿瘤临床特征的关系

目的主要分析凝血功能、D二聚体、血小板计数的变化与胃癌临床特征的关系,为临床进一步诊断肿瘤、寻找改善预后路径提供参考。方法选取我院于2016年1月-2018年12月间收治的189例胃癌患者为研究组,选取同一时间的健康体检者为对照组,采用相同的方法,对两组研究对象进行凝血功能、D二聚体、血小板计数的变化检验,评价两组研究对象,相关计数指标的差异。结果本次研究结果显示,研究组患者的PLT计数、D-二聚体、纤维蛋白原(Fbg)、aPTT水平等指标明显区别于对照组,组间数据差异具有统计学意义(P<0.05);不同临床分期的胃癌患者,各组间数据显示随着胃癌分期的增加,Fbg、D二聚体亦进行性增长;不同肿瘤侵犯深度组内,各组间数据显示随着肿瘤侵犯深度增加,患者D二聚体水平也逐渐升高(P<0.05);不同淋巴结转移胃癌患者中,转移组D二聚体水平均较无转移组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌患者的PLT计数、D二聚体、凝血功能均存在异常,尤其Fbg、D二聚体与肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移、血栓性疾病的形成明显相关,因此监测胃癌患者的PLT计数、D二聚体、凝血功能具重要意义。

存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达

本研究旨在构建含有人存活蛋白(survivin)基因的重组腺病毒载体,并探讨其在转染树突状细胞中的表达。以质粒pcDNA3.0-survivin为模板,通过PCR扩增获得survivin基因全长序列。PCR产物回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pShuttle-CMV-survivin。通过双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pShuttle-CMV-survivin转化E.coliBJ5183菌(含腺病毒骨架质粒)并进行同源重组,然后筛选阳性克隆,提取质粒,将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,将病毒上清转染树突状细胞,应用Westernblot方法分析survivin的表达。结果表明成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.65×109pfu/ml。Westernblot鉴定显示,经重组腺病毒转染的DC可有效表达survivin。结论含survivin基因的重组腺病毒载体的构建成功,为下一步开展抗白血病免疫研究奠定实验基础。

继发性血栓性血小板减少性紫癜17例临床分析

目的 总结分析继发性血栓性血小板减少性紫癜（继发性TTP）患者的临床表现、实验室特点及治疗,以提高对继发性TTP的诊断和治疗水平.方法 对我院2003年1月至2013年12月期间诊断为继发性TTP的17例患者的临床特点和治疗转归进行分析.结果 17例患者中10例（58.82％）出现三联征（血小板减少、微血管病性溶血性贫血、神经系统症状）;6例（35.29％）于病程中出现典型TTP五联征（发热、血小板减少、微血管病性溶血性贫血、神经系统症状和肾脏损害）.本组患者外周血涂片均可见破碎红细胞,范围为1.5％ ～16.5％.本组患者的治疗以血浆置换和输注血浆为主,联用糖皮质激素等免疫抑制剂,治疗有效率64.71％.结论 继发性TTP的诊断主要依赖临床特点,破碎红细胞比例＞1％作为诊断指标有助于早期诊断、早期治疗;不同原因继发性TTP预后不同,应积极处理原发病或消除诱导TTP发作的诱因,尽早给予血浆治疗,并联用糖皮质激素等免疫抑制剂以提高疗效、降低死亡率.

GM-CSF基因腺病毒表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的构建人GM-CSF基因的重组腺病毒载体,探讨其在树突状细胞(DC)中的表达。方法设计一对GM-CSF基因上下游引物,以质粒pBlu-hGM-CSF为模板,经PCR扩增获得GM-CSF基因全部序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-GM-CSF。经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将2种重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,并感染人树突状细胞。结果完成构建含有人GM-CSF基因的重组腺病毒,病毒滴度Ad-GM-CSF 5.2×109pfu/mL。RT-PCR及ELISA检测证实GM-CSF在DC中表达。结论构建重组腺病毒载体,并在DC表达GM-CSF抗原蛋白。

糖尿病酮症酸中毒合并高淀粉酶血症的相关因素

目的:探讨无并发急性胰腺炎的糖尿痛酮症酸中毒患者血淀粉酶升高的相关因素。方法:421例糖尿病酮症酸中毒患者,根据诊断标准排除急性胰腺炎,检测血淀粉酶、钠、钾、氯、钙、磷、肌酐、二氧化碳结合力、葡萄糖,次晨空暖腹血脂、肝功能,淀粉酶升高者,每4～8小时复查血淀粉酶。以血淀粉酶为应变量,以血糖等14个自变量进行多元线性回归分析。结果:葡萄糖、血钠、血渗透压、血三酰甘油与血糖显著相关(P<0.05)。结论:糖尿病酮症酸中毒患者血淀粉酶升高的主要原因是脱水、高血糖、高三酰甘油、高血渗透压,高血钠是血淀粉酶升高的加重因素。

结外NK/T细胞淋巴瘤患者检测EBV DNA载量的意义

目的:探讨接受门冬酰胺酶联合放疗的结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTL)患者检测治疗前后EBV DNA载量的临床意义。方法:回顾性分析25例初诊ENKTL患者临床资料,分析治疗前后EBV DNA载量与近期疗效和远期生存的关系。结果:全组随访2~57个月,中位随访21个月;7例出现疾病进展,进展时间2.5~37个月,中位进展时间10个月;6例因肿瘤相关死亡,时间2.5~46.5个月,中位时间16.75个月。3年OS和PFS分别为76.0%和72.0%。治疗后EBV DNA阳性者3年OS和PFS分别为50.0%和25.0%,初始治疗结束未达CR者3年OS和PFS分别为25.0%和0,与不良预后相关。结论:动态监测结外NK/T细胞淋巴瘤患者治疗前后的EBV DNA载量对于近期疗效和远期生存的预测具有一定指导意义。

如意金黄散加蜂蜜外敷治疗机械性静脉炎43例

目的探讨蜂蜜调剂如意金黄散外敷治疗机械性静脉炎的疗效。方法将78例PICC所致机械性静脉炎随机分为实验组(43例)及对照组(35例)。实验组使用如意金黄散适量加蜂蜜调匀成糊状,外敷于静脉炎处,对照组使用25%硫酸镁湿敷于静脉炎处。结果实验组总有效率为97.7%,对照组总有效率为82.9%,两者之间差异有统计学意义(P <0.05),实验组费用为(24.79±2.95)元,起效时间为(47.77±19.07)h,对照组费用为(36.60±3.99)元,起效时间为(79.63±16.71)h,两组人均费用及起效时间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论如意金黄散加蜂蜜治疗机械性静脉炎相比25%硫酸镁,起效快,费用省,效果好。

mTOR抑制剂雷帕霉素对伯基特淋巴瘤细胞增殖抑制的研究

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂雷帕霉素对伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞和CA46细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响及其作用机制,寻找其靶向治疗方法。方法:采用MTT法观察雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞增殖抑制作用,PI单染流式细胞术分析雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞周期分布的影响,Annexin V-FITC+PI双染流式细胞术分析雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞凋亡的影响,Western blot法检测雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞RPS6磷酸化水平及survivin、caspase-3蛋白表达水平的影响。结果:雷帕霉素能够明显抑制Raji细胞和CA46细胞的增殖,在雷帕霉素为1 nmol/L时,细胞增殖抑制率即达到20%,表现出雷帕霉素良好的生物活性,且抑制作用具有时间依赖性(r=0.507)和浓度依赖性(r=0.838)。不同浓度雷帕霉素分别作用于Raji和CA46细胞24和48 h后,与对照组相比,发现细胞周期处于G_1/G_0期细胞逐渐增多,S期和G2/M期细胞则逐渐减少,呈现时间依赖性(r=0.961)和浓度依赖性(r=0.947)。雷帕霉素100 nmol/L作用于Raji和CA46细胞48 h后,Annexin V+PI双染流式细胞术检测显示细胞明显凋亡,且主要为中晚期凋亡。Western blot法检测显示,雷帕霉素作用于Raji细胞和CA46细胞后,RPS6磷酸水平及survivin表达水平明显降低,caspase-3表达水平明显升高,且具有时间依赖性(r=0.926)和浓度依赖性(r=0.985)。结论:雷帕霉素能够通过抑制mTOR下游通路RPS6蛋白磷酸化,进而抑制mTOR/RPS6通路活化,阻滞细胞周期于G_1/G_0期,达到有效抑制伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞和CA46细胞增殖,同时下调抗凋亡蛋白survivin的表达,激活内源性促凋亡蛋白caspase-3而诱导细胞发生凋亡。

PI3K抑制剂LY294002对套细胞淋巴瘤增殖及药物敏感性的影响

目的探索LY294002对套细胞淋巴瘤细胞(MCL)株Jeko-1的增殖的影响及其化疗增敏作用。方法用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测Jeko-1细胞的增殖率及LY294002与阿霉素联用对Jeko-1细胞半数抑制率浓度的变化(IC50);采用流式细胞术检测Jeko-1细胞的细胞周期分布和细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法法检测PI3K/Akt信号通路Akt、RPS6K、P-4ebp1等下游蛋白的磷酸化水平。结果 LY249002可抑制Jeko-1细胞的增殖;LY294002使Jeko-1细胞G0/G1期的细胞数增加;LY294002有促Jeko-1细胞凋亡的作用,作用呈浓度依赖性(P<0.05);LY294002显著降低MCL细胞中P-Akt、P-RPS6K、P-4ebp1等蛋白的表达;LY29400可降低阿霉素对MCL细胞的IC50(P<0.05)。结论 LY294002可抑制MCL细胞的增殖,该抑制作用可能是通过下调PI3K/Akt信号通路中Akt等相关下游蛋白的磷酸化水平而实现,且LY294002或许是MCL治疗中具有化疗增敏作用的分子靶向药物。

维生素K4对获得性维生素K依赖性凝血因子缺乏症的临床疗效

目的探讨在获得性维生素K依赖性凝血因子缺乏症的患者中运用维生素K4口服制剂进行维持治疗的临床可行性。方法回顾性分析了24例确诊获得性维生素K依赖性凝血因子缺乏症的患者,静脉运用或肌注维生素K1治疗至临床出血停止、PT恢复正常后,其中9例改成维生素K4口服治疗,另15例则继续维生素K1静脉或肌注治疗,观察其临床出血表现、疗效及不良反应。结果在维持治疗2周后PT差异无统计学意义(P>0.05),且在维持治疗期间,维生素K4口服治疗组相对常规治疗组无明显肝毒性作用(P>0.05)。结论维生素K4口服维持治疗本病安全、有效、方便,患者依从性好,无明显不良反应。

出院患者实施电话随访对减少医疗纠纷的作用

目的探讨血液科出院患者实施电话随访对于减少医疗纠纷的作用。方法将我科2015年出院患者按出院时间先后分组,1~6月532例为对照组,只接受出院指导;7~12月548例为实验组,除接受出院指导外,还由责任护士及总值班护士长在规定时间内根据院部制定的表格对其实施电话回访。结果实验组医疗纠纷的发生率少于对照组（P〈0.001）。结论在出院后实施电话随访减少医疗纠纷。

原发性血小板增多症患者中CALR与JAK2基因突变型的临床特征的比较

目的通过研究原发性血小板增多症(ET)患者中CALR及JAK2两种不同基因型突变的临床资料,比较两种不同基因型突变的ET患者的基本资料(性别、年龄)、病史(出血史、血栓史)、体征(脾大、肝大)及外周血液指标(白细胞、血小板、血红蛋白、D-二聚体)间的异同,结合相关文献探讨上述临床参数与基因型突变的相关联系。方法收集2015年9月1日至2017年9月1日期间就诊我院门诊及住院部的首诊ET病人,共统计病例数37例。根据患者基因检测结果分列为JAK2 V617 F基因突变组及CALR基因突变组,并分别采集患者的基本资料、病史、体征及外周血液指标,利用统计学对比不同基因型突变组之间上述基本信息、背景资料及外周血象部分指标(白细胞、血小板、血红蛋白、D二聚体)的参数资料,并结合国内外文献,比较两种基因型突变间的临床特征。结果①在37例原发性血小板增多症患者中共检出24例JAK2 V617 F基因突变阳性,占病例总体的64.9%;共检出13例CALR基因突变阳性,占总病例数的35.1%;未检测至其它基因突变阳性。②ET患者中JAK2 V617 F基因突变组的血栓史事件发生率高于CALR基因突变组,且具有统计学意义(P=0.013<0.05)。③ET患者中JAK2 V617 F基因突变组的外周血白细胞计数高于CALR基因突变组,且具有统计学意义(P=0.009<0.05)。④ET患者中CALR与JAK2 V617 F基因突变组两组间的性别分布、发病年龄、出血史、肝脾增大、外周血象中的血小板、血红蛋白及D-二聚体的参数资料在数学上未发现具有统计学意义的差异(P>0.05)。结论①本课题中的ET患者中JAK2 V617 F基因突变阳性与CALR基因突变阳性的比例较国内外研究基本一致。②相较于CALR基因突变阳性的ET患者,JAK2 V617 F基因突变阳性的ET患者具有更高的白细胞计数及血栓事件发生率。③携带JAK2 V617 F基因突变的ET患者与携带CALR基因突变的ET患者相比,具有更差的生存预后及更高的血栓事件风险。

嵌合抗原受体T细胞靶向PD-L1的初步研究

目的:采用嵌合抗原受体(CAR)T细胞技术将肿瘤免疫检查点抑制剂序列(MEDI4736)整合至CART细胞,构建一种新的抗PD-L1的CART(αPDL1-CART)细胞,并探索αPDL1-CART细胞的作用机制。方法:共培养结合实验检测αPDL1-CAR的结合性,流式细胞术分析αPDL1-CART细胞表达,细胞毒性实验检测αPDL1-CART细胞杀伤性。结果:αPDL1-K562细胞可特异性结合PDL1-K562细胞,阳性表达率为(48.9±13.9)%;与T vs K562组、T vs PDL1-K562组和αPDL1-CART vs K562组相比,αPDL1-CART vs PDL1-K562组αPDL1-CART细胞可显著减少PDL1-K562细胞数[(2 136.9±766.1)个,P<0.05]。结论:αPDL1-CART细胞可特异性结合和杀伤PDL1-K562细胞,将进一步促进CART细胞与免疫检测点结合研究。