柚皮素通过基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4信号轴对脂多糖作用下人牙周膜干细胞抗炎、成血管和成骨分化能力的影响

目的探究柚皮素(Nar)对脂多糖(LPS)刺激下的人牙周膜干细胞(hPDLSCs)抗炎、成血管和成骨能力的影响及其机制。方法采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、划痕试验和Transwell实验研究hPDLSCs的增殖和迁移能力。采用碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色、管腔形成实验、酶联免疫吸附实验(ELISA)、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白印迹实验(Western blot)检测hPDLSCs抗炎、成血管和成骨分化能力。结果10μmol/L Nar可减轻10μg/mL LPS刺激的hPDLSCs炎症反应,促进其增殖、迁移和成血管分化,0.1μmol/L Nar可有效恢复10μg/mL LPS刺激的hPDLSCs成骨能力。加入CXCR4抑制剂AMD3100后,Nar促进抗炎和成骨分化的作用降低,炎性hPDLSCs成血管分化升高。结论Nar促进了hPDLSCs抗炎、成血管和成骨分化,该作用与基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4信号轴有关。

高迁移率族蛋白B1及ERK1/2通路对张应力下人牙周膜细胞自噬的影响

背景:正畸牙移动骨重塑的机械力信号转导通路及其调控机制是正畸生物力学和生物学研究的热点。目前正畸牙移动过程中张力侧牙周膜细胞对机械刺激反应的复杂分子信号网络机制尚不太明确。目的:探究正畸牙移动过程中张应力作用下高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein 1,HMGB1)和ERK1/2通路对人牙周膜细胞自噬的影响。方法:选取第3-5代生长状态良好的人牙周膜细胞,施加周期性张应力,利用免疫荧光观察HMGB1在细胞中的分布情况,RT-qPCR及Westernblot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和HMGB1的表达水平,完成张应力加载后分别提取胞核蛋白和胞浆蛋白,Westernblot分别检测胞核及胞浆中HMGB1蛋白水平。为探究HMGB1通过何种机制参与调控细胞自噬,使用丙酮酸乙酯(HMGB1胞浆抑制剂)进行细胞处理,通过免疫荧光、RT-qPCR和Western blot检测细胞自噬水平。最后,选用PD98059抑制ERK1/2通路,通过RT-qPCR以及Western blot检测自噬水平变化,探讨HMGB1通过ERK1/2通路调控自噬的机制。结果与结论:(1)通过体外张应力加载,诱导了人牙周膜细胞内自噬水平升高,HMGB1的表达增加,同时HMGB1发生了由胞核到胞质的转位;(2)人牙周膜细胞通过HMGB1核质转位机制参与张应力作用下自噬的调控;(3)使用ERK1/2通路抑制剂PD98059显著抑制了张应力作用下HMGB1引起的细胞自噬;(4)结果表明,张应力作用下HMGB1从细胞核转移到细胞质,并通过ERK1/2途径调节自噬,维持人牙周膜细胞的稳态和牙周动态平衡。

饥饿条件下活性氧通过PINK1/Parkin通路调控人牙周膜细胞的线粒体自噬

目的探究人牙周膜细胞(hPDLC)在饥饿条件下活性氧(ROS)与PINK1/Parkin通路介导hPDLC线粒体自噬的具体机制。方法分离培养正常牙周组织的hPDLSC,利用Earle’s平衡盐溶液(EBSS)模拟饥饿环境诱导hPDLC线粒体自噬,利用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)抑制ROS生成以探讨ROS在hPDLC线粒体自噬的作用,利用环孢素A(CsA)抑制PINK1/Parkin通路以研究ROS与PINK1/Parkin通路在饥饿条件下激活hPDLC中的作用。采用流式细胞术及JC-1线粒体膜电位检测试剂盒,检测线粒体膜电位;采用透射电镜观察线粒体自噬体的生成及线粒体形态变化;采用线粒体红色荧光探针定位线粒体,溶酶体绿色荧光探针定位溶酶体;采用DCFH-DA ROS荧光探针检测ROS生成强度;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中线粒体自噬基因(Tomm20、Timm23)及PINK1/Parkin通路的表达水平,采用蛋白质印迹(Western blot)检测细胞中线粒体自噬蛋白(Tomm20、Timm23)及PINK1/Parkin通路蛋白表达水平。结果EBSS饥饿作用30 min后,诱导激活hPDLC线粒体自噬的作用最强,ROS表达增加,且线粒体自噬相关基因(Tomm20、Timm23)下调(P<0.001),PINK1/Parkin通路表达上调(P<0.001)。NAC抑制ROS的产生后,自噬被抑制,同时Tomm20、Timm23表达上调(P<0.001,P<0.05),PINK1/Parkin通路表达下调(P<0.001,P<0.05)。而当CsA抑制PINK1/Parkin通路表达时(P<0.05,P<0.05),自噬被逆转,同时Tomm20、Timm23表达上调(P<0.001,P<0.01)。结论ROS在饥饿条件下主要通过PINK1/Parkin通路增强hPDLC线粒体自噬。

“红色复合体”致病菌裂解液对人牙周膜细胞成骨分化能力的影响

目的:探讨“红色复合体”牙周致病菌裂解液对人牙周膜细胞成骨分化能力的影响。方法:收集因正畸需要而拔除的健康前磨牙,原代培养人牙周膜干细胞(hPDLCs);采用免疫荧光方法和成骨分化诱导实验对培养的原代hPDLCs进行鉴定;体外联合培养牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体和福赛斯坦纳菌,建立“红色复合体”模型,扫描电镜对其进行鉴定;制备“红色复合体”裂解液,通过碱性磷酸酶试剂盒、实时定量PCR、茜素红染色,检测裂解液对hPDLCs碱性磷酸酶活性,成骨分化相关基因表达的影响;以及对hPDLCs成骨矿化能力的影响。结果:在“红色复合体”裂解液的刺激下,hPDLCs碱性磷酸酶活性,成骨分化相关基因ALP、Runx2、OPN、COL1的表达以及成骨矿化水平显著降低。结论:“红色复合体”牙周致病菌能够抑制hPDLCs的成骨分化能力。