基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法的建立

目的:建立基于人成淋巴TK6细胞的体外磷脂酰肌醇聚糖A类(PIG-A)基因突变试验方法,研究甲基磺酸乙酯(EMS)与苯并芘(B[a]P)诱导TK6细胞PIG-A 基因突变的能力,并探讨该方法用于药物开发初期遗传毒性筛选和评价的前景。方法:通过免疫磁珠分离清除TK6细胞株中预先存在的GPI(-)细胞(即PIG-A 基因突变细胞),然后连续40 d测定正常传代培养TK6细胞PIG-A 基因的自发突变率。设不添加体外代谢活化系统长时处理组(24 h -S9)和添加体外代谢活化系统短时处理组(4 h +S9),并分别采用3个不同浓度50、75、100 μmol/L的EMS和4、8、16 μmol/L的B[a]P处理TK6细胞10 d,在第11天收获细胞。使用CD19、CD55、CD59抗体和核酸染料7-AAD对细胞进行标记,然后用流式细胞仪分析CD19阳性细胞中,CD55和CD59表达阴性的细胞频率。结果:经过免疫磁珠分离,TK6细胞中预先存在的PIG-A 基因突变细胞频率降低至2.5×10-5。连续测定40 d TK6细胞的PIG-A 基因自发突变率,计算得到其自发突变率为5.04×10-7个/d。与阴性对照组比较,不同浓度EMS和B[a]P诱导产生的PIG-A 基因突变细胞比例均呈剂量依赖性增加,并超过阴性对照组的2倍以上。结论:本研究初步建立了基于TK6细胞的体外PIG-A 基因突变检测方法。该方法成本较低,简便、快速,具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力。

人类磷脂酰肌醇聚糖A类基因突变在遗传毒性研究中应用进展

基因突变是遗传毒性损伤的重要检测终点。国际人用药物注册技术协调会议(ICH)M7指南中将啮齿类动物体内磷脂酰肌醇聚糖A类(Pig-a)基因突变试验列为药物杂质遗传毒性试验阳性结果的追加试验。啮齿类动物Pig-a基因突变试验作为一项新的检测体内基因突变的方法,相对于转基因动物等其他体内基因突变试验,具有成本低、方法简单和检测快速的优点。基于Pig-a基因的物种保守性,近年来开发了检测人外周血以及体外人细胞的PIG-A基因突变试验的方法,以期用于临床基因突变监测以及非临床遗传毒性评价。本文主要对PIG-A基因突变试验研究常用人外周血成熟红细胞、网织红细胞和白细胞及TK6细胞和MCL-5细胞检测方法等进行简要综述。

纳米银颗粒及纳米二氧化钛颗粒的体外遗传毒性研究

纳米物质以其独特的物理性质广泛用于化妆品、医药和食品工业,但它们的安全性和遗传毒性仍然存在争议。本研究拟采用基于人成淋巴TK6细胞的体外彗星实验整合体外PIG-A基因突变实验对纳米银颗粒(AgNPs)和纳米二氧化钛颗粒(TiO2NPs)的致DNA断裂作用和致突变性进行初步研究。本研究探究了最高至200μmol/L浓度时,TK6细胞暴露于两种纳米物质4 h时的彗星实验和经过暴露24 h以及10 d基因突变表达期后的PIG-A基因突变结果。同时,本研究还检测了TK6细胞暴露于纳米颗粒4 h及24 h对纳米物质的摄取能力。在纳米物质摄取实验中,随着纳米物质浓度的升高,TK6细胞在流式细胞仪检测图中的侧向散射角(side scatter,SSC)呈现浓度与时间依赖性升高,表明TK6细胞可摄取两种纳米颗粒。在4 h彗星实验中,AgNPs可导致彗星尾DNA荧光%强度呈现浓度依赖性显著升高,为阳性结果。而TiO2NPs则不能诱导彗星尾DNA荧光%强度呈现浓度依赖性显著升高,但最高浓度组尾DNA荧光%超过本实验室阴性历史对照数据,为可疑结果。而在体外PIG-A基因突变实验结果中,AgNPs和TiO2NPs均不能诱导TK6细胞的PIG-A基因突变率出现阳性升高。AgNPs可导致TK6细胞出现DNA损伤,但不能诱导PIG-A基因突变率升高。TiO2NPs既不能诱导TK6细胞出现DNA损伤,也不能诱导PIG-A基因突变率升高,TiO2NPs的遗传毒性有待进一步验证。

一种体外多终点遗传毒性检测方法

目的建立一种操作简单、快速和准确的体外多终点遗传毒性检测方法。方法将组蛋白γ-H2AX、P53蛋白、磷酸化组蛋白H3(p-H3)以及活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)4个生物标志物整合到γ-H2AX灶点试验中。DNA断裂剂依托泊苷(未加S9条件下,0.2,0.4,0.8和1.6 mg·L^(-1))、环磷酰胺(S9条件下,3.75,7.5,15和30 mg·L^(-1))和非整倍体诱导剂秋水仙素(未加S9条件下,0.0063,0.0125,0.025和0.05 mg·L^(-1))处理TK6细胞24 h,收获细胞、固定,洗涤后加入抗体标记,流式细胞仪检测γ-H2AX、P53蛋白和p-H3荧光强度。选择4种不同作用机制的DNA断裂剂(有S9条件下,丝裂霉素C 0.05,0.1和0.2 mg·L^(-1),甲磺酸甲酯3,6和12 mg·L^(-1),苯并芘0.5,1和2 mg·L^(-1),顺铂2.5,5和10 mg·L^(-1);无S9条件下,分别加丝裂霉素C 0.025,0.05,0.1 mg·L^(-1),甲磺酸甲酯1.5,3和6 mg·L^(-1),苯并芘25,50和100 mg·L^(-1),顺铂1.25,2.5和5 mg·L^(-1))、2种非整倍体诱导剂(S9条件下,长春新碱0.005,0.01和0.02 mg·L^(-1),紫杉醇0.02,0.04和0.08 mg·L^(-1);未加S9条件下,长春新碱0.01,0.02和0.04 mg·L^(-1),紫杉醇0.005,0.01和0.02 mg·L^(-1))和3种不具有遗传毒性的化合物(有/无S9条件下,氯化钠125,250和500 mg·L^(-1),氨苄青霉素G 125,250和500 mg·L^(-1),盐酸普萘洛尔15,30和60 mg·L^(-1)),对该方法进行验证。结果在方法建立阶段,与溶剂对照组相比,无S9依托泊苷组和有S9的环磷酰胺组γ-H2AX和P53蛋白荧光强度增加,且依托泊苷组1.6 mg·L^(-1)和环磷酰胺30 mg·L^(-1)组组荧光强度为溶剂对照组的2倍以上,p-H3阳性细胞比例无显著升高;秋水仙素组γ-H2AX和P53蛋白荧光强度无明显变化,p-H3细胞比例为溶剂对照组2倍以上。在方法验证阶段使用多种不同作用机制的化合物验证得到的灵敏度(6/6)和特异性(3/3)均较高。结论建立了体外多终点遗传毒性检测方法,该方法具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力。

下一代测序技术在遗传毒性研究中的评价

生物技术的进步和成本的降低激发了下一代测序(next generation sequencing,NGS)技术应用范围的扩大。尽管基因组学、转录组学及表观遗传研究表现的是不同方面,但是它们都可以使用测序来进行研究。随着NGS技术发展,使其在医学领域里也得到了广泛的应用,尤其是在肿瘤研究和精准医疗中显示了前所未有的优势。因此,也吸引了遗传毒理研究者,用NGS技术研究诱变剂引起的不同突变类型,相关研究正在不断深入。本文通过总结NGS技术在遗传毒理学方面的研究进展,简单剖析NGS技术的发展,NGS技术在遗传毒性研究的优势与劣势,及其成为常规的遗传毒性研究方法的可能。

Pig-a基因突变在遗传毒性评价中的应用进展

近年来,遗传毒理学界对磷脂酰肌醇聚糖A(Pig-a)基因突变的研究提示其可成为量化体内和体外突变事件的潜在工具。本文综述近年来发表的Pig-a相关的研究文献,从Pig-a基因突变检测方法进展、药物遗传毒性评价中的应用进行归纳,详细地总结了Pig-a基因突变在大鼠中的应用,并对Pig-a基因突变试验跨物种研究的探索以及NGS技术对Pig-a基因突变检测作一阐述,为后续研究提供参考。

Bhas 42细胞转化试验高通量检测方法的建立

目的建立基于96孔板的Bhas 42细胞转化试验高通量检测方法,并探讨此方法用于药物非临床阶段体外致癌性评价的前景。方法建立Bhas 42细胞转化试验96孔板高通量检测方法,使用已知阳性诱癌物苯并芘(Benzoapyrene,BaP)和环磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)为对照品,比较转化灶人工计数法和过氧化氢高通量96孔板法对结果判定的影响。进行试验的细胞在接种后第19天以一定浓度的过氧化氢处理细胞24 h。24 h后,洗去含过氧化氢的培养基,加入新鲜培养基并加入CCK-8染色孵育2～4 h后测定450 nm波长吸光度以确定细胞转化率。同时,转化灶人工计数法细胞在第21天经甲醇固定,吉姆萨染液染色后计数每孔克隆数,对比两种方法的差异性。结果转化灶人工计数法中,与阴性对照组比较,BaP和CP在启动试验中均被评价为阳性;过氧化氢高通量法得到与转化灶人工计数法相同的结果。结论成功建立了基于96孔板的Bhas 42细胞转化试验的过氧化氢高通量检测方法,该方法相比于传统方法可简单、快速地检测化合物诱导Bhas42细胞的转化效率,并提高了结果评判的客观性。