人巨细胞病毒gp52蛋白基因片段的克隆及表达

目的为获得高表达人巨细胞病毒 ｇｐ５２蛋白基因的工程菌。方法通过计算机分析，筛选出巨细 胞病毒蛋白ｇｐ５２中优势抗原决定簇，用ＰＣＲ技术扩增克隆了含强抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插 入表达载体ｐＥＴ２８（ａ）内，转化大肠杆菌ＢＬ２１，经Ｓｅｐｈａｒｅｒｙ１ Ｓ－２００分子筛及Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ螯合层析进行纯化。结 果获得的工程菌所表达的 ｇｐ５２蛋白片段相对分子质量约为 ２１ ０００，约占菌体可溶性蛋白的 ２８％。获得的表达蛋 白纯度达９５％，电泳显示单一条蛋白带，ＥＬＩＳＡ分析证实有较强的抗原性和较好的特异性。结论本研究对人巨细 胞病毒感染，尤其是对孕妇及献血员等感染的检测有重要意义。

TPO模拟肽与人IgG1 Fc片段的融合表达及其生物学特性研究

依据本室获得的人TPO模拟肽序列 ,合成了该模拟肽的DNA序列 ,分别连接至 4种不同长度的人IgG1Fc基因片段的 5′端 ,并克隆至质粒表达载体pET2 8a(+) ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,筛选获得了 4种重组工程菌 ,其中3种分别高效表达了 3种不同长度的融合蛋白 ,而第 4种工程菌未表达。表达的 3种融合蛋白的分子量分别约为2 8kD、12kD和 12kD ,表达量约占菌体蛋白总量的 30 %左右 ,纯化获得了 3种TPO模拟肽融合蛋白。 3种融合蛋白均有较好的体外活性 ,维持TPO依赖细胞Ba F3-mp1生长的EC5 0分别为 :13、10、10nmol L。用血小板减少症小鼠动物模型 ,测定了它们的体内活性 ,3种融合蛋白均有升高血小板和缩短血小板恢复时间的功能 ,分别比TPO模拟肽活性提高了 18、8、8倍 ;而对白细胞及红细胞无显著影响。分别用 3种融合蛋白免疫BALB c小鼠 ,均未刺激小鼠产生抗TPO模拟肽抗体 ,并显示了较好的应用潜力。

弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合表达、纯化及抗原性分析

利用基因工程技术制备抗原性好的弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合蛋白 ,并用作抗原检测弓形虫抗体。根据弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列 ,通过计算机分析 ,筛选出其中较强的抗原决定簇。用PCR方法分别扩增含抗原决定簇的基因片段。将这两个基因片段克隆至同一质粒pET2 8a(+)内 ,表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,筛选表达该融合蛋白的工程菌。纯化表达的融合蛋白 ,用已知的 6份抗弓形虫IgM阳性血清和大量正常人血清 ,ELISA法检测纯化融合蛋白的抗原性和特异性。获得了高效表达含弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的工程菌 ,表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 2 5 %。纯化获得了表达的融合蛋白 ,该蛋白有较好的抗原性和特异性。表达的弓形虫GRA6和P30融合蛋白可用做抗原检测弓形虫抗体 ,用于临床及孕妇检测 ,对优生优育有较大意义。

多肽在生物医药和诊断试剂中的应用

简要介绍多肽作为药物及诊断试剂的特点、主要的筛选途径及国内外研究概况。系统介绍多肽在疫苗、抗肿瘤、抗病毒及抗菌药物、导向药物、细胞因子模拟肽。

丙型肝炎病毒非结构3区基因片段的克隆表达及抗原纯化鉴定

通过逆转录ＰＣＲ技术，从中国江苏省丙型肝炎病人血清中扩增克隆了丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的非结构３区的部分基因片段（Ｃ３３）。ＤＮＡ序列分析证实，该片段全长８４２ｂｐ。在合成的一对逆转录ＰＣＲ引物上，上游引物增加了ＮｃｏⅠ酶切位点（内含起始密码子ＡＴＧ），下游引物上增加了ＳａｌⅠ酶切位点及终止密码子ＴＡＡ，将克隆的Ｃ３３基因片段克隆至表达载体ｐＢＶ２２１内，获得了表达Ｃ３３抗原的工程菌，表达Ｃ３３抗原分子过为３０ｋＤ，经尿素裂解纯化、分子筛分离纯化及复性后进行离子交换和反相亲和层析纯化，获得的重组蛋白经ＥＬＢＡ和免疫印迹等证实有较好的抗原性和特异性。

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌内的表达及应用

将从中国丙肝病人血清中扩增克隆的丙型肝炎病毒核心蛋白基因（４０８ｂｐ）酶切处理后插入表达载体ｐＪＬＡ５０２内，获得高表达核心蛋白的重组工程菌。将重组菌经４２℃热诱导５ｈ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明，表达的核心蛋白占菌体蛋白总量的２０％。经分子筛和吸附层析纯化后获得的核心蛋白，ＥＬＩＳＡ检测证实有较好的抗原性和特异性。用表达的核心抗原加用表达的ＮＳ＿３抗原（Ｃ＿３３）装配的抗－ＨＣＶ试剂盒，经用标准血清验证及与国外第二代抗－ＨＣＶ试剂盒比较，证实符合丙肝诊断试剂要求。

丙型肝炎病毒核心蛋白的高效表达及纯化

用新型表达载体PGEX4T－2在大肠杆菌内高效表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。所表达的核心蛋白融合有谷优甘肽转移酶，用Sepharose4B—GSH凝胶一步亲和层析纯化即可获得高纯度的核心蛋白、该蛋白具有较好的抗原性和特异性。

弓形虫P30蛋白抗原表位的克隆表达及纯化鉴定

目的构建表达P30蛋白抗原表位的重组质粒及工程菌,获得纯化的P30蛋白抗原表位,用于检测弓形虫特异性抗体。方法采用PCR技术,设计一对引物(P30P3、P30P4),从弓形虫基因组DNA中扩增出编码P30蛋白抗原表位的基因片段,与载体pET28a(+)连接,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDSPAGE分析。用离子交换纯化表达的P30抗原表位,用ELISA鉴定其抗原性。结果表达的P30蛋白抗原表位以包涵体形式存在,纯化的P30蛋白抗原表位片段有较好的抗原性,可用于检测弓形虫抗体。结论已成功构建了高表达P30蛋白的工程菌,为研制弓形虫抗体检测试剂或疫苗奠定了基础。

人IL-18的基因克隆、表达及纯化

目的 :克隆人IL 1 8基因 ,并构建高表达人IL 1 8的工程菌 ,纯化获得重组人IL 1 8。方法 :从人肿瘤组织内提取总RNA ,利用逆转录聚合酶链反应扩增人IL 1 8基因 ,在基因的 5′和 3′端分别加上NcoI和EcoRI酶切位点 ,酶切后直接克隆至质粒表达载体pET2 8a( + )内 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,挑选转化子 ,IPTG诱导后SDS PAGE筛选高表达人IL 1 8的工程菌。提取表达菌质粒进行DNA序列分析。表达菌大量培养及IPTG诱导后 ,超声破菌收集包涵体 ,十二烷基肌苷酸钠溶解后用阳离子柱和分子筛纯化。结果 :克隆的人IL 1 8基因序列完全正确 ,工程菌表达的人IL 1 8约占菌体蛋白 30 % ,以包涵体形式存在 ,经阳离子柱和分子筛纯化获得了较纯的人IL 1 8。结论 :可用构建的工程菌大量制备人IL 1 8,为开展人IL 1 8药物的临床前研究奠定了基础。

用国产重组抗原研制丙肝病毒抗体检测试剂

用克隆表达的丙型肝炎病毒核心蛋白及非结构 3区蛋白、非结构 4区蛋白和非结构 5区蛋白作为抗原 ,研制装配了第三代丙肝病毒抗体检测试剂。用该试剂检测国家第三代丙肝病毒抗体检测试剂标准血清 ,40份阴性血清全部符合 ,40份阳性血清出现 1份假阴性。

抗丙肝病毒NS5蛋白单克隆抗体的研制及鉴定

用基因重组的丙肝病毒 ＮＳ５蛋白免疫Ｂａｌ ｂ／ｃ ／小鼠，制备免疫脾Ｂ淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤Ｓｐ２／０细胞系融合，筛选获得了１株能分泌抗 ＮＳ５蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该株单克隆抗体为 ＩｇＧ１。ＥＬＩＳＡ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ证实该株单抗对 ＮＳ５蛋白有较好的特异性。

丙肝病毒非结构4区和5区抗原的克隆表达及纯化鉴定

通过分析丙肝病毒（ＨＣＶ） 的非结构４ 区（ＮＳ４） 和５ 区（ＮＳ５）蛋白的氨基酸序列，推测确定抗原决定簇位点。用ＲＴ－ ＰＣＲ 技术从中国丙肝病人血清中扩增克隆含抗原决定簇基因的ＮＳ４ 及ＮＳ５ 基因，将该两段基因分别克隆至质粒表达载体ｐＥＴ２８ａ（ ＋ ） 内，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ，构建成功了高效表达ＮＳ４ 和ＮＳ５ 蛋白的工程菌，ＩＰＴＧ 诱导后两蛋白在工程菌内的表达量分别约占菌体蛋白的３３ ％ 和２８ ％ 。经Ｓｅｐｈａｒｃｒｙｌ Ｓ－ ２００ 分子筛及Ｎｉ－ ＮＴＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ 螯合层析纯化，获得了较纯的重组ＮＳ４ 和ＮＳ５ 蛋白。用纯化的ＮＳ４ 和ＮＳ５ 蛋白作抗原ＥＬＩＳＡ 法检测ＨＣＶ抗体阴、阳性血清，证实它们有较好的抗原性和特异性。

广谱高特异性重组丙型肝炎病毒抗原的制备纯化及鉴定

利用逆转录PCR技术克隆了中国株HCV的核心蛋白基因和非结构3区蛋白基因,DNA序列无分析显示克隆的基因片段属HCV-Ⅰ型。将二个基因片段分别克隆至质粒表达载体内,构建了多株表达融合和非融合核心蛋白的工程菌及表达非结构3区蛋白的工程菌。建立了二种重组蛋白的纯化方法,

粒/巨噬细胞集落刺激生长因子的基因克隆表达

利用逆转录聚合酶链反应从人外周血淋巴细胞克隆获得全长ｃＤＡＮ，将ｃＤＮＡ片段克隆至质粒表达载体ＰＢＶ２２１内，转化大肠杆菌ＤＨ５α筛选获得了高表达人粒／巨噬细胞集落刺激生长因子的工程菌。表达的人粒／巨噬细胞集落刺激生长因子经ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００分子筛纯化及ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ阴离子交换纯化，获得了高纯度的粒／巨噬细胞集落刺激生长因子。

吸入液体气溶胶的沉积和转运

本文研究了液体气溶胶(MMI)=0.89μm σ_g=2.0)在豚鼠体内的沉积和转运.四组豚鼠分别暴露2、5、10和30min.测定结果表明:随暴露时间延长,呼吸系统及上消化道各部位沉积百分比逐渐下降;血、尿内浓度逐渐升高.暴露时间在10min之间时,总沉积及呼吸系统内沉积构成比变化不大.

基因治疗的研究进展

随着分子生物学的发展,人们对基因的结构、功能,表达调控等方面的研究更加深入,逐步实现从分子(基因)水平上研究生命的发展规律。近10年来植物,哺乳动物细胞基因工程的研究迅速开展。将基因工程用于人类临床治疗的研究也已广泛开展。笔者现就目前国内外基因治疗的几个热点做一简要综述。遗传病的基因治疗基因治疗(Gene therapy)是指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内,以弥补致病基因的功能缺陷,或提供一个额外基因以获抗病能力。多用于治疗遗传病、肿瘤、传染病及内分泌系统疾病等。

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆与表达

以含有丙型肝炎病毒核心蛋白基因的质粒pJLA502-C为模板,用PCR方法重新扩增克隆了核心蛋白基因,在扩增基因的上下端分别增加了NCOⅠ及SalⅠ酶切位点。将克隆的基因酶切后插入表达载体pBV221内,转化大肠肝菌DH_(5α),获得表达非融合核心蛋白的工程菌,42℃热诱导5hr,表达蛋白占菌体蛋白总量的15％。经包涵体纯化及分子筛纯化等,获得核心蛋白,经ELISA及Western Blotting分析表明有较好的抗原性和特异性。

气溶胶在动物体内沉积的测定方法

本文描述了测定气溶胶在动物体内沉积的几类方法,主要包括吸入及呼出气溶胶浓度变化测定法、同位素标记技术、解剖测定法、磁学测定法、形态学方法以及微生物气溶胶沉积的测定方法等,讨论了方法的原理及应用,并比较了几种方法的优缺点。另外,本文还提到了一些新的检测技术。

应用NPCR发现我国Kawasaki型恙虫病立克次体

本文报告用恙虫病立克次体表面蛋白５６ＫＤａ型特异抗原（ｔｓａ５６ＫＤａ）基因编码区的引物，采用嵌合式聚合酶链反应（ＮＰＣＲ）鉴定江苏地区的２株恙虫病立克次体。结果该２株恙虫病立克次体与Ｇｉｌｌｉａｍ，Ｋａｒｐ，Ｋａｔｏ和Ｋｕｒｏｋｉ型特异引物无任何ＤＮＡ扩增带，而与日本ｋａｗａｓａｋｉ株型特异引物扩增后有５２３ｂｐ的ＤＮＡ扩增带，表明我国存在Ｋａｗａｓａｋｉ型恙虫病立克次体。