杜仲叶免疫调节机制的网络药理学分析及验证

基于网络药理学及小鼠免疫抑制模型方法探讨杜仲叶免疫调节的作用机制。该研究通过TCMSP数据库筛选出3个杜仲叶活性成分,Uniprot和Swiss Target数据库预测到306个相关联的靶基因,经与OMIM、GeneCards数据库对比,获得105个免疫失调与杜仲叶的交集基因,通过Cytoscape3.8.2软件构建“活性成分-基因”网络。利用STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用分析,构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI),CytoNCA进行网络拓扑学分析,筛选出21个核心靶点,并对核心靶点进行基因本体(GO)富集分析与KEGG通路分析。结果发现,杜仲叶中的山奈酚、槲皮素、绿原酸等主要化合物通过调节肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素6(IL-6)、血管内皮生长因子A (VEGFA)、白细胞介素1β(IL^(-1)β)等关键靶点,参与IL^(-1)7、肿瘤坏死因子信号通路等,从而发挥免疫调节作用。通过腹腔巨噬细胞体外试验和环磷酰胺免疫抑制体内试验探讨杜仲叶提取物的免疫调节作用,结果显示,1 000~5 000μg·mL^(-1)浓度的杜仲叶提取物可促进腹腔巨噬细胞增殖和吞噬能力;与模型组相比,杜仲叶提取物可增加小鼠免疫器官指数、吞噬指数、外周血白细胞和淋巴细胞数量,增强迟发型超敏反应(DTH)的耳廓肿胀。本研究展现了杜仲叶免疫调节多成分、多靶点作用的特点,为杜仲叶在畜禽健康养殖中的应用提供了科学依据。

杜仲水提物诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞向神经元样细胞分化

目的 探讨杜仲水提物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(Rat pheochromocytoma cells, PC12细胞)向神经元样细胞分化的作用。方法 用0~10 mg·mL^(-1)杜仲水提物培养PC12细胞4 d,双抗噻唑蓝法(MTT法)检测吸光度(A值)并选取最佳浓度配置杜仲诱导培养基;诱导4 d后通过免疫荧光标记神经丝蛋白H(neurofilament-H,NF-H)检测诱导情况;通过免疫蛋白印迹检测细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)及磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal regulated kinases, p-ERK)表达情况。结果 不同浓度杜仲培养4 d的PC12细胞,与空白对照A值相比,1~3 mg·mL^(-1)剂量组有增高趋势;4~7 mg·mL^(-1)剂量组有降低趋势;8~10 mg·mL^(-1)剂量组显著降低(P<0.05)。4 mg·mL^(-1)含杜仲诱导培养基培养PC12细胞4 d, 90%以上分化为神经元样细胞,细胞胞体变大,突起伸长,互相连接成网,约20%突起长度> 30μm,显著高于对照组。随着诱导时间的延长,NF-H表达逐渐增多增强,诱导4 d后,约90%以上的细胞NF-H强阳性表达,p-ERK蛋白表达水平较对照组明显降低。结论 杜仲水提物能够诱导PC12细胞分化为神经元样细胞,表达神经元特异蛋白神经丝蛋白,其机制可能与ERK信号通路调节密切相关。

心脏成纤维细胞生物表型多样性

目的探讨心脏成纤维细胞(CFs)生物表型多样性。方法新生1~3天SD大鼠12只,胰蛋白酶/胶原酶联合消化法分离培养新60只生大鼠CFs,比较原代和传代培养细胞形态学变化,免疫组织化学学检测鉴定常见成纤维细胞标记波形蛋白(vimentin)、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)和盘状结构域受体(DDR2)的表达,细胞免疫荧光检测CFs干细胞标记nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90的表达,细胞免疫荧光三标技术检测CFs干细胞标记间的共表达情况。结果酶联合消化法分离培养的CFs收获细胞量大,第3代细胞活力好、纯度高。Vimentin、FSP1和DDR2在CFs中均表达,但DDR2在CFs中呈强表达。部分CFs分别表达nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90,部分nanog阳性的CFs分别和CD73、CD90和sca-1,及其CD90和sca-1存在共表达,nanog^+/CD73^+共表达阳性率最高(59.02%±8.39%),与其他3组相比差异均有极显著性(P<0.01);而nanog^+/CD90^+共表达阳性率与nanog^+/sca-1^+之间差异无显著性(P>0.05),但这两组与CD90^+/sca-1^+相比差异均有极显著性(P<0.01);CD90^+/sca-1^+共表达阳性率均低于其他3组,差异具有极显著意义(P<0.01)。结论 CFs是具有干细胞特征混合细胞群,在表型上具有多样性。

新生大鼠心肌telocytes在体外培养状态下的分裂方式

目的探讨体外培养新生大鼠心肌telocytes的分裂方式。方法采用0.1%胶原酶I/0.125%胰蛋白酶联合消化法分离培养新生大鼠心肌telocytes,活细胞工作站动态捕捉和苏木素染色检测telocytes的分裂方式。结果酶联合消化法培养新生大鼠心肌telocytes纯度高、活力好,增殖迅速。无丝分裂时,胞核变大,以出芽方式生长,形成哑铃状细胞核,核芽逐渐拉伸并与母细胞分离。有丝分裂前中期,染色质缩短变粗为染色体,整齐地排列在赤道板处;分裂末期,染色体到达两极,子核已初步形成;胞质分裂期,胞质逐步拉开,形成两个子细胞。在有丝分裂不同时期,心肌telocytes均保持其原有的形态特征。结论体外培养心肌telocytes增殖时有丝分裂和无丝分裂两种方式并存。

新生大鼠心脏成纤维细胞体外分裂方式

目的 观察体外培养状态下心脏成纤维细胞（CFs）的形态特征和分裂增殖方式。方法原代培养新生大鼠CFs，免疫荧光双标法分别检测波形蛋白和磷酸化组蛋白H3（H3P）共表达，波形蛋白和微管蛋白共表达。利用活细胞工作站和荧光显微镜观目的 观察处于不同分裂期的细胞时相。结果CFs 0．5～1h贴壁，培养2～3d细胞增殖旺盛，大量细胞进入有丝分裂期，其中多数CFs先隆起变圆，而少数则仍维持扁平状进行分裂。偶见无丝分裂现象。圆隆型有丝分裂时长为20～30min，扁平型分裂时长为40～50min。分裂前期胞核形状规则，H3P开始表达；前中期核膜破裂，纺锤体形成；中期染色体排列在赤道面，H3P高表达，纺锤体呈典型纺锤样；后期染色单体分开并移向两极，H3P在染色单体上持续表达；末期两个子核形成，微管聚集在两子核之间；胞质分裂期，两个子细胞形成，H3P不表达。结论体外培养的CFs存在圆隆型和扁平型两种有丝分裂形态，在分裂方式上存在有丝分裂和无丝分裂两种形式。

体外培养状态下心肌细胞有丝分裂的证据

目的探讨体外培养状态下心肌细胞有丝分裂、增殖的证据。方法分离新生大鼠心肌细胞,分别原代培养0h至12d;免疫荧光分别双标心肌肌钙蛋白-T（c Tn T）、磷酸化组蛋白H3（H3P）和微管蛋白（tubulin）,利用活细胞工作站和荧光显微镜观察处于分裂期的心肌细胞。结果原代培养的心肌细胞生长状态好、纯度高,可观察到分裂各期的心肌细胞及其微管蛋白的变化。处于分裂各期的心肌细胞不隆起变圆仍维持扁平状。分裂前期细胞核形状规则,染色质凝集,H3P开始表达;前中期核膜破裂,纺锤体形成;中期染色体排列在赤道面,纺锤体呈典型纺锤样;后期染色单体分开并移向两极;末期子核形成,平行微管聚结在两子核之间;胞质分裂期形成两个子细胞,两个细胞分开后,可见有少量微管呈丝状连接。原代培养1～12d的心肌细胞在整个细胞分裂图像中很少见到双核心肌细胞。培养第3天开始发现分裂象的心肌细胞,占总心肌细胞数的2/127（1.57%）和1/92（1.09%）,培养第7天,分裂细胞比率达3/69（4.35%）和5/163（3.07%）,培养第12天有2/100（2%）和0/60（0）的心肌细胞处于分裂期。结论体外培养的心肌细胞存在一定数量的完全有丝分裂,是心肌增殖和心肌再生的细胞学证据。

新生大鼠多器官成纤维细胞nanog蛋白的表达差异

目的探讨新生大鼠心、肝、脾、肺、肾和皮肤中成纤维细胞nanog蛋白表达差异及其意义。方法用免疫组织化学、免疫荧光和体外细胞培养技术,对成纤维细胞进行nanog蛋白和波形蛋白(vimentin)标记,检测并比较新生大鼠不同器官中成纤维细胞nanog蛋白和vimentin表达及共表达特征。结果新生大鼠心、肝、脾、肺、肾和皮肤6种器官中均有nanog蛋白和vimentin表达,在每个器官中均有少数成纤维细胞共表达这两种蛋白,共表达率分别为心(10.07±0.77)%、肝(9.97±3.70)%、脾(11.23±2.98)%、肺(15.07±2.87)%、肾(11.75±2.76)%、皮肤(16.14±1.28)%,其中皮肤和肺的共表达率高于心、肝、脾、肾(P<0.05)。结论共表达nanog蛋白和vimentin的成纤维细胞可能更具有干细胞样特性;新生大鼠皮肤和肺的成纤维细胞可能更具有组织损伤修复潜能。

大鼠心肌梗死后心功能变化与新生血管的关系

目的探讨大鼠心肌梗死后心功能变化及其与血管新生之间的关系。方法结扎大鼠左冠状动脉前降支,制备心肌梗死模型,术后利用心脏彩超分别评价梗死后1周、2周、3周和4周的心功能,采用免疫组织化学和Western blotting方法,检测各周大鼠梗死边缘Ⅷ因子和血管内皮生长因子(VEGF)的表达变化。结果大鼠心肌梗死1周时心功能最差,2周和3周心功能有所改善,4周时心功能降低;Ⅷ因子与VEGF于术后1周、2周呈高表达,3周表达开始降低,4周时已接近正常水平。结论梗死后心功能的变化与血管新生不一致,心肌梗死早期血管密度的增加不能明显改善心功能。

心肌脂肪酸代谢和心肌脂毒性损伤研究进展

健康成年人50%~70%的心肌三磷腺苷来自于长链脂肪酸的β氧化,获取的脂肪酸除供线粒体氧化功能外多余的部分以三酰甘油的形式储存于心肌细胞的脂滴中,并在需要时由三酰甘油酯酶水解为脂肪酸和甘油。正常心肌脂肪酸的摄取和氧化维持在一个动态平衡,过多的脂质在心肌内聚集会造成心肌脂毒性,心肌脂毒性可以造成心肌胰岛素抵抗、心肌细胞凋亡和心脏收缩功能障碍,实验和临床数据表明,减少毒性脂质可以改善心肌代谢和功能。目前临床上对心肌的脂毒性损伤尚未引起足够重视。本文查阅近年来国内外文献,就心肌脂肪酸代谢途径和心肌脂毒性、潜在性的脂毒性物质以及与临床的关系进行综述。