3T3-L1脂肪细胞诱导分化与肿瘤抑制因子PTEN的表达研究

目的优化3T3-L1脂肪细胞分化条件,研究信号因子PTEN在分化过程中的表达,以了解PTEN是否通过表达量来调节正常脂肪细胞形成,为探索PTEN的药物靶标作用奠定基础。方法DMEM高糖培养基培养3T3-L1脂肪前体细胞,地塞米松、3-异丁基1-甲基黄磦呤(IBMX)和胰岛素按2种组合方案分别诱导3T3-L1细胞分化,油红O染色鉴定脂肪细胞,蛋白裂解液提取细胞总蛋白,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分化过程中PTEN的表达量,用生物信息学进行小鼠和人类PTEN的同源性分析。结果1μmol/L地塞米松、0.5μmol/LIBMX和5μg/ml胰岛素诱导48h后,再用含5μg/ml胰岛素的DMEM高糖营养液培养48h的方案对3T3-L1细胞诱导分化效果较好,脂肪细胞分化率高且均一,在分化第10天可见90%以上细胞分化为脂肪细胞。PTEN在脂肪细胞分化过程中表达量在第0、4th、6th、9th和第12天时不一致,在12天时明显下降,显著低于诱导前。同源性比对分析表明,小鼠和人类的PTEN mRNA编码序列匹配率为96%,而氨基酸序列匹配率为100%。结论内源性PTEN在小鼠3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化为脂肪细胞的时相过程中表达量有所变化,提示PTEN可能在生理条件下即可发挥提高胰岛素敏感性和促进脂肪细胞形成的作用。

风湿性心脏病心肌组织噬菌体表达文库的构建和分析

目的:构建风湿性心脏病患者心脏组织噬菌体表达文库。方法:外科手术治疗中取风湿性心脏病患者新鲜心耳组织,用QIAGEN试剂盒提取RNA,用逆转录酶合成cDNA第一链,用长距离PCR合成双链cDNA,SfiⅠ酶切cDNA后过柱分级收集,用T4 DNA连接酶重组连接入λTripl Ex2载体,最后用λ噬菌体包装后构建成原始文库,用PCR、X-gal等方法进行文库质量鉴定。结果:构建了风湿性心脏病心肌组织噬菌体表达文库,原始文库滴度为3.3×106pfu/mL,重组率为99%,81.25%外源重组片段大于1kb。结论:成功构建了高质量的风湿性心脏病患者心肌组织噬菌体表达文库,为风湿性心脏病的分子机制寻找新的研究策略奠定了实验基础。

探讨脑梗死患者凝血象和血小板变化

目的:探讨脑梗死患者凝血象和血小板变化情况。方法:选取2008年3月～2013年3月我院收治的100例脑梗死患者(观察组)以及健康体检者100例(对照组),均检测凝血象与血小板,并对检测结果进行比较分析。结果:APTT、PT及TT几项凝血象指标方面,观察组检测水平均相对较低,FIB水平则相对较高;PLT血小板参数检测水平,观察组明显低于对照组,PDW与MPV则明显高于对照组;以上相关比较均有显著性差异(P<0.05)。结论:检测凝血象以及血小板相关指标,对诊断脑梗死有重要的临床参照价值,值得临床推广应用。

广州市褐云玛瑙螺感染广州管圆线虫的调查分析

目的对广州市褐云玛瑙螺(Achatina fulica)感染广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)第Ⅲ期幼虫的情况进行调查和比较,填补广州市广州管圆线虫病的流行病学资料。方法分别于2000年7月和2004年7月对广州市天河区、海珠区和越秀区褐云玛瑙螺进行采样收集,消化法分离第Ⅲ期幼虫,计算感染率和感染度并与过去及国内其它地区进行比较,用灌胃法构建大鼠和小鼠动物模型,检测脑部和心肺晚期虫体。结果广州市褐云玛瑙螺广州管圆线虫感染率,2000年为44.2%(57/129),感染度401条/螺,而2004年为27.3%(33/121),感染度为72条/螺,2次感染率差异有显著性(χ2=7.5,P<0.01),各区褐云玛瑙螺的感染率差异较大,最高达65.9%。褐云玛瑙螺的感染率与其螺重呈正比。用分离的第Ⅲ期幼虫构建了小鼠和大鼠动物模型,分别从脑部和心肺检出较晚期虫体。结论广州市褐云玛瑙螺的广州管圆线虫感染率和感染度2004年较2000年有明显下降,2004年感染率低于曾发生过广州管圆线虫病暴发流行的地区;小鼠适于构建广州管圆线虫第Ⅳ、Ⅴ期模型,大鼠适于构建第Ⅴ期和成虫模型。

一株能降解胆固醇的乳酸菌的选育

利用选择性培养基从成年人的粪便中分离出 1株能降解胆固醇的乳酸菌 ,该菌能以胆固醇作为生长的唯一能源。在 10 %牛奶的发酵试验中 ,该菌能使牛奶发酵并凝固。在液体发酵中 ,胆固醇的降解率为 34 6 %。经初步鉴定 ,该菌为双歧杆菌 (Bifidoacteriumsp .)。

异常HbK复合β地中海贫血家系及其风险胎儿的产前诊断

目的了解一种由β珠蛋白肽链合成异常的HbK复合轻型β地中海贫血的家系及其风险胎儿的产前诊断。方法用美国Helena公司全自动快速电泳分析系统进行血红蛋白电泳各区带定量分析和反向点杂交-RDB法进行β地贫基因联合检测,对家系及风险胎儿进行产前诊断。结果先证者为异常HbK复合β珠蛋白基因IVS-Ⅱ-654突变双重杂合子,临床表型为中间型β地贫。父亲为β-珠蛋白基因IVS-Ⅱ-654突变杂合子,母亲为异常HbK杂合子,再次妊娠行产前诊断的胎儿为异常HbK杂合子,母亲和胎儿地贫基因型正常,建议保留胎儿。出生后8个月随访结果与产前诊断一致。结论对β珠蛋白肽链合成异常和β地贫基因携带者的家庭进行遗传咨询和产前诊断,可预防中间型β地贫患儿出生。采用电泳技术联合β地贫基因检测技术,可在产前诊断中解决同类问题。

风湿性心脏病自身抗原RHDAG1的获得与鉴定

目的探索用风湿性心脏病患者噬菌体表达文库构建和免疫筛选方法来研究风湿性心脏病的自身抗原候选分子。方法提取风湿性瓣膜性心脏病患者心肌组织总RNA,分离纯化mRNA并逆转录合成长链cDNA,用噬菌体载体构建表达文库,用风湿热患者血清免疫筛选该库,对筛选获得的自身抗原基因进行鉴定、生物信息学分析、体外表达、Western blotting鉴定和免疫反应结合性分析。结果成功构建了风湿性心脏病患者心脏组织噬菌体表达文库,原始文库滴度为3.3×106pfu/ml,重组率为99%,81%外源片段大于1kb。通过免疫筛选方法获得了自身抗原RHDAG1,该自身抗原与人类角蛋白18同源,能与活动性风湿热患者血清和风湿性心脏病患者血清结合,而与体检健康人血清无结合。结论构建噬菌体展示文库方法可以有效地用于筛选和获得风湿性心脏病患者自身抗原;本研究提示自身抗原RHDAG1可成为风湿热和/或风心病的候选分子标志物。

多重PCR快速检测金黄色葡萄球菌中氨基糖苷类抗生素耐药基因及其临床应用

目的建立金葡菌氨基糖苷类抗生素耐药基因的多重PCR快速检测体系,了解耐药基因acc(6′)-Ie+aph(2″)、aph(3′)-Ⅲat ant(4′)-Ia在广州地区的流行分布。方法采用VITEK-60或PHOENIX-100微生物自动鉴定系统鉴定菌株及药敏试验,利用琼脂扩散法检测4种氨基糖苷类抗生素的耐药表型。通过优化PCR体系建立多重PCR并应用于检测金葡菌氨基糖苷类抗生素耐药基因。结果构建了四重PCR快速检测体系,124株金葡菌临床分离株中,acc(6′)-Ie+aph(2″)、aph(3′)-Ⅲa和ant(4′)-Ia的检出率分别为62.1%、32.3%和1.6%;所有庆大霉素、奈替米星以及阿米卡星耐药的金葡菌菌株均检测到上述3个耐药基因中的1个或1个以上基因;74株mecA阳性菌株中72株(97.3%)检测到acc(6′)-Ie+aph(2″)基因。结论所构建的多重PCR检测体系为临床实验室提供快速而有效的菌株耐药基因检测手段。编码AAC(6′)-APH(2″)双功能酶的acc(6′)-Ie+aph(2″)基因是金葡菌最重要的氨基糖苷类抗生素耐药基因,其次为aph(3′)-Ⅲa,ant(4′)-Ia则少见。

广州管圆线虫中间纤维蛋白的体外表达和初步免疫学鉴定

目的对广州管圆线虫中间纤维蛋白(intermediate filament,IF)基因进行体外表达、纯化、鉴定和抗原性质分析。方法将IF基因的重组表达载体pET-IF在大肠杆菌中表达,表达产物经组氨酸亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量,质谱分析氨基酸序列,生物信息学分析蛋白质结构,Western blot鉴定与人、大鼠和小鼠感染血清及人IgG4亚类的抗原反应性。结果SDS-PAGE、质谱分析和Western blot证明本研究获得的纯化蛋白为预期蛋白IF,其分子量为47.8kDa,肽指纹图谱与秀丽杆线虫IF蛋白家族具有高度同源性,并具有典型的IF结构特征,且IF结构的尾部存在抗原决定簇,融合蛋白IF能与大鼠感染血清、小鼠感染血清和患者血清IgG结合,也能与患者IgG4亚类结合。结论体外获得了抗原IF纯化蛋白,研究显示其可用于人类外周血检测并有助于检测现症感染和疗效考核。

反向点杂交法在β-地中海贫血基因诊断中的应用

目的初步评价反向点杂交法对β-地中海贫血基因的诊断效能。方法使用反向点杂交法对1 004例疑似β-地中海贫血病例进行基因诊断。结果1 004例外周血样品中有283例β-地中海贫血。共发现11种突变,其中CD41-42(40．89％),IVS-2-654(22．68％),CD17(12．71％),TATAbox-28(14．43％),CD43 (3．78％)和CD26(1．72％),占突变的95％以上。结论反向点杂交法具有快速、准确的优点,适用于普通人群的β-地中海贫血分子检测和产前诊断。

广州管圆线虫GAMMA-BBH基因的克隆表达鉴定和荧光定量检测

目的亚克隆和表达广州管圆线虫γ-丁基甜菜碱羟化酶(γ-butyrobetaine hydroxylase,GAMMA-BBH)基因,对该蛋白属性进行鉴定,定量检测不同虫龄该目的基因表达量。方法PCR扩增GAMMA-BBH cDNA基因,产物经NcoⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切后连接至原核表达载体重组为pET-BBH,在BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot和酶活性测定鉴定表达产物,用荧光定量PCR方法检测广州管圆线虫不同虫龄GAMMA-BBH的表达量。结果PCR和核苷酸序列测定结果表明pET-BBH构建正确并能在IPTG诱导下表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表明表达产物分子量与预期分子量(Mr=48500)一致,酶学测定显示表达产物有GAMMA-BBH的酶活性,荧光定量PCR方法检测结果显示GAMMA-BBH在虫体不同虫龄期表达量不一致。结论目的基因能正确编码并表达具有酶活性的GAMMA-BBH,该酶的表达量与虫龄和寄生部位可能有关。

不同样品提取方法对地中海贫血基因诊断的影响

目的:考察不同全血基因组提取方法对地中海贫血基因诊断的影响。方法:使用酚/氯仿抽提法、盐析法、Chelex快速法和硅吸附法提取全血基因组DNA。使用分光光度计和电泳法检测提取DNA的质量。结果:4种方法提取的DNA无明显质量差异,但地中海贫血基因检测试剂盒检测结果标明,除Chelex快速法提取的DNA有时会出现扩增效果不好外,其他方法提取的DNA都可获得满意的效果。结论:4种基因组提取方法均可用于地中海贫血的基因诊断,但在临床应用中应格外小心。

中国人群少见血红蛋白H病的分子遗传学特征分析

目的分析由少见基因类型导致的血红蛋白H病家系的分子遗传学特征。方法采用标准的血液学分析技术检测先证者及家系成员红细胞参数,包括RBC、Hb、MCV、MCH、MCHC和RDW,进行表型诊断。利用SPIFE快速自动电泳分析系统检测其血红蛋白组分Hb A、HbA2、Hb F、Hb H和Hb Bart′s。采用反向斑点杂交技术诊断-地中海贫血基因非缺失突变,利用gap-PCR扩增特异位点序列并对扩增序列进行克隆测序,明确突变位点。结果先证者母亲MCV、MCH均降低,Hb A2为2.39%且亨氏小体阳性,基因检测结果为泰国型缺失杂合子。先证者父亲各红细胞参数正常,但RDB检测结果为携带CS点突变。先证者及其弟表现为中重度小细胞低色素贫血,蛋白电泳结果显示他们均有Hb H和Hb Bart′s带,先证者Hb H为10.8%,Hb Bart′s为7.51%,其弟Hb H为14.78%,Hb Bart′s为9.11%,基因检测结果证实该姐弟均为Hb H病患者,遗传了母亲的泰国型缺失片段和父亲的CS点突变,故地中海贫血型别为THAI/CS。结论首次报道中国人群少见的H病类型THAI/CS地贫基因类型是中国人群少见的H病类型,丰富了中国人群珠蛋白基因突变谱。

广州管圆线虫抗原IF的中间纤维蛋白组织来源分析和定位

目的对广州管圆线虫抗原IF进行中间纤维蛋白家族分类和细胞组织定位。方法IPTG诱导重组基因pET-IF在大肠杆菌中表达广州管圆线虫抗原IF,用组氨酸亲和层析纯化表达产物,用Western blot方法鉴定抗原IF的中间纤维蛋白类型;小鼠皮下多点注射法制备抗IF抗体血清,用免疫组织化学方法检测抗原IF在虫体组织和细胞上的定位。结果广州管圆线虫抗原IF在体外成功表达并纯化,其属于中间纤维蛋白家族的角蛋白,定位于广州管圆线虫成虫肠管壁,存在于细胞质中。结论广州管圆线虫抗原IF分布于虫体肠管壁,同时从组织学角度证明广州管圆线虫存在中间纤维结构。

广东省耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec分型研究

目的分析本地区分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)葡萄球菌盒染色体mec(SCCmec)类型。方法利用3套多重PCR体系扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec型特异性位点、共同位点、鉴别位点、内参照位点以及mec基因复合物和ccr基因复合物进行SCCmec分型。结果分离的156株MRSA中,6株MRSA不能分型,可分型率为96.2%。其中,Ⅲ型SCCmec 125株,占83.3%,Ⅱ型SCCmec 11株,占7.3%,Ⅳ、Ⅴ型SCCmec各7株,占4.7%。结论本地区分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌流行携带最多耐药基因的Ⅲ型SCCmec。

人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库的构建及质量分析

目的:各种病因引起的心脏瓣膜纤维化是导致心脏瓣膜功能丧失的主要原因,样本来源有限和不可重获性是其分子机制研究的瓶颈。本研究旨在成功获取患者纤维化瓣膜的遗传信息物质,为探明瓣膜病变的分子机制提供直接证据。方法:心脏换瓣手术中取纤维化瓣膜组织,提取高质量RNA,用SMART技术合成cDNA第1链,再用长距离PCR合成双链cDNA,经Sfi I酶切后过柱分级收集长片段cDNA,经T4 DNA连接酶催化连接入λTriplEx2载体,最后经λ噬菌体包装后构建成原始文库,用PCR、X-gal等方法进行文库质量鉴定。结果:成功构建了纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库,原始文库滴度为8×109 pfu/L,重组率为99%,外源基因片段大小在500到3 000 bp之间,其中81.25%片段大于1 000 bp。结论:成功构建了高质量的人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库,该文库的库容量足够代表人类基因的复杂性,高重组率能保障功能筛选的高效性,长片段更有助于全长基因的获得和表达。

柯萨奇B组病毒在心血管疾病发生中的作用

目的:了解柯萨奇B组病毒(CVB)在心脏疾病患者中的感染状况,探讨CVB感染与心血管疾病的内在关系。方法:采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),进行CVBIgG抗体和核酸检测。结果:心脏病组CVB IgG阳性率为44.8%(112/250),对照组抗体阳性率为16.7%(18/108),两者有显著性差异(P<0.05)。CVB RNA检测结果显示,心脏病组阳性率为20.4%(51/250),对照组为3.7%(4/108),两者比较有显著性差异(P<0.05)。结论:在心脏病患者中CVB感染较普遍,应引起重视。

聚合酶链反应联合地高辛标记探针诊断病毒性心肌炎分析

目的:评价基因检测手段在病毒性心肌炎(VM C)病原学诊断中的作用。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、地高辛标记CBV-cDNA探针检测了120例心肌炎患者血标本中的柯萨奇B组病毒(CBV)。结果:RT-PCR阳性检出率:心肌炎组为48.33%,对照组4.41%(P<0.01)。斑点杂交阳性检出率:心肌炎组为51.67%,对照组4.41%(P<0.01)。结论:PCR联合地高辛标记探针诊断病毒性心肌炎,不失为一种敏感、特异、简便、可靠的方法。