整联蛋白研究进展

对细胞膜信号转导过程中起重要作用的整联蛋白的结构和功能、整联蛋白与肿瘤生长和转移的关系。

人恶性黑色素瘤A375细胞黑素刺激素受体(MC1R)的检测

目的检测人恶性黑色素瘤A375细胞膜上MC1R蛋白及其cDNA,为研究黑色素瘤细胞表面受体及靶向配体奠定基础。方法利用放射配体分析法检测人恶性黑色素瘤A375细胞膜上的MC1R蛋白;用RTPCR方法扩增人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R的cDNA,并克隆至pMD18T质粒,进行酶切分析鉴定及扩增片段DNA序列测定。结果放射配体分析结果表明,125IαMSH可与人恶性黑色素瘤A375细胞膜特异结合。RTPCR结果显示,扩增产物的大小与MC1R的cDNA相符。测序结果证实扩增片段为MC1R基因的特异片段。结论证实人恶性黑色素瘤A375细胞膜上表达MC1R蛋白。MC1R基因的成功克隆为其进一步研究提供了必要条件。

人MC1R基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R基因在Sf9昆虫细胞中的表达。方法以pMD18-T-MC1R为模板,利用PCR方法扩增人MC1R基因,将MC1R基因连接到pfastBac1质粒上,与穿梭载体DH10Bac转座,获得Bacmid-MC1R质粒后,通过脂质体介导,转染Sf9细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE检测表达产物,放射受体分析法检测目的蛋白MC1R活性。结果Bacmid-MC1R质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱,在相对分子质量为35000处有一条新生蛋白带。放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和,具有生物学活性。结论MC1R基因成功在真核细胞中得到表达。

EGF-PE35KDEL重组毒素的基因构建及表达

目的 构建表达有特异细胞毒性融合蛋白的工程质粒。方法 利用PCR扩增出PE3 5KDEL基因片段 ,经酶切后插入EGF PET2 8A载体 ,并转化至BL2 1(DE3 )中。采用Westernblot对重组毒素进行鉴定。结果EGF PE3 5KDEL重组毒素占菌体总蛋白的 2 0 % ,分子量约为 410 0 0。结论 EGF PE3

人白细胞介素2-Linker-PE38重组毒素的构建

目的 构建人白介素 2 linker PE38融合基因 ,为进一步表达具有特异性杀伤作用的融合蛋白奠定基础。方法 用PCR方法扩增绿脓杆菌外毒素 (PEA)衍生物PE38基因及柔性连接肽linker片段 ,并与人白介素 2 (Interleukin2 ,IL2 )基因连接插入质粒pET2 8a中。结果 构建的表达载体经核苷酸测序分析无突变发生。结论 成功地构建了表达质粒pIL2 linker Pe38。

抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素基因的克隆与表达

目的扩增抗癌胚抗原单链抗体(CEA-ScFv),与绿脓杆菌外毒素(PE40)进行重组及原核表达,旨在进一步研究重组蛋白CEA-ScFv-PFA0的靶向抗肿瘤作用。方法分别扩增抗癌胚抗原单链抗体的重链区、轻链区,用overlap PCR按照VH-VL的顺序连接,克隆至pMD18T载体中。再将VH-VL基因片段与含有.PE40的表达载体pET28a连接,转化B121(DE3),IPTG诱导表达。结果经DNA测序,其结果与设计完全相符。SDS-PAGE分析,在相对分子质量66000处可见明显表达带,表达量可占菌体蛋白总量的13％以上。免疫印迹表明重组蛋白具有PF40的抗原特异性。结论抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素的成功克隆与表达,为进一步研究其生物活性奠定基础。

EGF-Ang融合蛋白的构建、表达及活性研究

目的:构建由人表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和人血管生成素(angiogenin,Ang)组成的人源化的融合蛋白,并检测其对肿瘤细胞的靶向杀伤能力。方法:利用基因工程技术将EGF和Ang基因连接起来,克隆到高效表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pEGF-Ang,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白(EGF-Ang)。经DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析纯化后,用MTT法检测复性蛋白的细胞毒性。结果:SDS-PAGE和薄层扫描分析表明外源蛋白的表达量占菌体裂解蛋白总量的18.6％。细胞活性检测表明EGF-Ang重组蛋白能明显地抑制Hep2细胞的生长,而不影响MA104细胞的正常生长。结论:融合蛋白EGF-Ang在体外对过度表达EGFR的Hep2细胞具有明显的杀伤作用。

可溶性重组蛋白EGF-Ang构建及体外细胞毒性检测

目的 构建人源化的免疫融合蛋白 ,以期获得具有较低免疫原性的靶向治疗药物。方法 利用基因工程技术将人表皮生长因子 (EGF)和人血管生成素 (Ang)基因连接起来 ,克隆到高效表达载体pET2 0b(+)中 ,构建重组表达质粒pET2 0 EA ,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白 (EGF Ang)。用MTT法检测可溶性蛋白的细胞毒性作用。结果 经SDS PAGE和薄层扫描分析表明 ,外源蛋白表达量占菌体裂解蛋白总量的 6 .4 %。细胞活性检测表明EGF Ang重组蛋白在体外对过度表达EGFR的Hep2 和SP2 / 0细胞具有明显杀伤作用。结论 人源化免疫融合蛋白EGF

口蹄疫病毒衣壳蛋自前体P1基因和蛋白酶3C基因的克隆及序列分析

［摘 要］目的 对口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因进行PCR扩增、克隆和序列分析，了解FMDV基因型与血清型的相关性及分子免疫机理，便于疫苗株的选择。方法 应用RT－PCR方法扩增了 CC－1毒株的衣壳蛋白前体 P1基因和蛋白酶 3C基因，并将其克隆到pGEM-T easy载体上，分别构建含有P1基因和3C基因的两个重组质粒pGEMP1和pGEM3C，并进行核苷酸序列分析。结果CC-1株与相同血清型毒株P1基因核苷酸序列和氨基酸序列存在较高的同源性，与不同血清型毒株P1基因氨基酸序列的同源性差异显著，而不同血清型毒株的蛋白酶3C基因氨基酸序列的同源性均在 90％以上。结论 成功地克隆了 FMDV P1区基因和蛋白酶3C基因，为选择口蹄疫病毒疫苗株提供了背景材料。

金属——玻璃(釉)热喷复合防腐管道技术

1技术内容 该技术是将玻璃釉热喷到钢管内外壁表面上,形成玻璃与金属复合防腐涂层.这种涂层是当今防腐性能最为优越的一种材质,不含任何有毒物质.