膜吸附法结合可视化环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病菌

【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等。前3种方法都需要依靠准确的柑橘黄龙病诊断技术。【目的】利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),结合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen荧光染料可视化,建立黄龙病田间核酸快速检测方法。【方法】以黄龙病菌β-操纵子与原噬菌体DNA聚合酶基因为模板设计LAMP特异性引物,包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB和茎引物StemF/StemB。通过对环引物和茎引物设定不同的用量组合,对LAMP引物体系进行优化,确定合适的引物浓度。用优化后的LAMP引物体系对188份田间柑橘叶片进行检测,并构建受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析实时荧光LAMP(qLAMP)在CLas检测上的准确性。对qLAMP预混反应液进行两步的常温干燥,分别设定不同的存放条件,评估LAMP常温干燥试剂的稳定性。用本研究建立的CLas可视化LAMP快速检测方法,对田间71个柑橘叶片样品和35个柑橘果实样品进行检测,与实时荧光定量PCR(qPCR)比较两者的符合率。【结果】在LAMP体系中加入环引物、茎引物或增加其浓度都能促进反应速率的提升,并且同时加入终浓度均为1.6μmol·L-1的环引物和茎引物能进一步提高LAMP反应速率。LAMP预混液通过两步法干燥在不同温度存放1—4周均能保持反应活性基本不变,表明制备的两步法干燥LAMP试剂检测性能较好,在低温和常温环境下的稳定性尚可,仅35℃高温存放会略微增加LAMP试剂的反应时间。使用孔径0.1μm尼龙膜代替纤维素滤纸作为核酸吸附材料能提升CLas快速诊断技术的灵敏度。结合DNA快速提取和可视化LAMP建立的CLas快速核酸诊断方法最低能检测到浓度为102 copies/μL的重组质粒样品,总体准确率高。经配对卡方检验,该方法的诊断结果与qPCR无显著差异。可视化LAMP快速检测相较常规检测有着更低的成本和耗时,而且可视化LAMP快速检测无需离心机和PCR仪等昂贵的仪器,仅需一台65℃恒温设备即可。【结论】建立的CLas快速核酸检测方法成本低,30 min即可观察到检测结果,操作简便,准确性高,可替代qPCR在田间进行黄龙病的快速鉴定。

柑橘黄龙病菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

建立基于双重荧光定量PCR检测柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)的方法,并对其准确性进行验证。通过受试者工作特征(ROC)曲线、净重分类改善指数(NRI)和综合判别改善指数(IDI)分析7对CLas实时荧光PCR引物及其联合检测的准确性,评价RNRf/RNRr联合CLas-4G/HLBr的双重实时荧光PCR对CLas的检测价值。ROC曲线分析结果显示,表现最好的引物是RNRf/RNRr,其曲线下面积(AUC)为0.971,高于其他6对引物;其次是CLas-4G/HLBr引物,AUC为0.966;在双引物联合检测中,RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr引物串联检测、CQULA04F/CQULA04R+RNRf/RNRr引物并联检测的相关性能指标较优,AUC分别为0.963和0.966,并且RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr引物串联检测同时具备较高的敏感性(85.19%)和特异性(99.25%)。NRI分析结果表明RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr串联检测的诊断能力相较于LJ900f/LJ900r的单一引物实时荧光PCR显著提升了6.00%(P<0.05)。使用RNRf/RNRr和CLas-4G/HLBr两对引物进行双重实时荧光PCR,发现RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr双重实时荧光PCR比单一引物实时荧光PCR有更高的灵敏度。因此,RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr双重实时荧光PCR可作为柑橘黄龙病低发区的早期诊断工具。