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S-亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达系统的构建及手性胺的合成
被引量:
1
1
作者
李骥璇
余磊
+2 位作者
李京美
郑桂兰
王洪钟
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第1期105-111,共7页
旨在构建S-亚胺还原酶(S-IRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)在大肠杆菌中的一菌双酶共表达系统,实现辅酶NADPH的再生,高效合成手性仲胺。利用无缝克隆的手段设计构建一种单质粒双启动子共表达系统,以全细胞为催化剂催化手性仲胺S-2-甲基吡咯烷(S...
旨在构建S-亚胺还原酶(S-IRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)在大肠杆菌中的一菌双酶共表达系统,实现辅酶NADPH的再生,高效合成手性仲胺。利用无缝克隆的手段设计构建一种单质粒双启动子共表达系统,以全细胞为催化剂催化手性仲胺S-2-甲基吡咯烷(S-2MP)的合成,并研究温度、pH及有机溶剂对双酶反应的影响。成功构建了S-IRED和GDH的重组共表达质粒,实现了S-IRED与GDH在大肠杆菌中的胞内共表达,以亚胺2-甲基吡咯啉(2MPN)为模式底物,以工程菌全细胞催化手性仲胺S-2MP的合成,在低辅酶添加时催化手性胺的产率和光学纯度均高于95%。该双酶共表达体系的最适温度和pH分别为37℃和pH 8,10%以下的甲醇对双酶反应有正向促进作用。大肠杆菌胞内双酶共表达系统的构建实现了辅酶NADPH的原位再生,降低了亚胺还原酶催化合成手性胺的成本,为手性胺的规模制备奠定了基础。
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关键词
亚胺还原酶
葡萄糖脱氢酶
共表达
手性胺
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职称材料
蔗糖磷酸化酶全细胞催化AA-2G的条件优化
被引量:
6
2
作者
余磊
李骥璇
+2 位作者
王忆茗
郑桂兰
王洪钟
《现代生物医学进展》
CAS
2017年第14期2601-2605,共5页
目的:使用表达蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-spase,作为全细胞催化剂,合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)。通过反应条件的优化研究,提高...
目的:使用表达蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-spase,作为全细胞催化剂,合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)。通过反应条件的优化研究,提高AA-2G的收率。方法:分别考察菌体量、缓冲液pH、蔗糖浓度、维生素C浓度、反应时间和温度对AA-2G合成反应的影响,再组合上述最佳条件进行反应。AA-2G的产量使用高效液相色谱法进行定量。结果:最佳反应条件为:菌体量15 mg/mL,缓冲液pH 4.5,蔗糖浓度100 g/L,维生素C浓度175 g/L,反应时间20 h,温度37℃。在此条件下,AA-2G产量达到了35.7 g/L。结论:以蔗糖为底物,使用SPase合成AA-2G的研究报道较少。本研究通过优化此方法的反应条件,让AA-2G的产量得到了大幅提高。同时本研究中成功地采用了大肠杆菌工程菌作为全细胞催化剂,这比传统的使用粗酶液的方法更省时省力,有良好的应用潜力。
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关键词
蔗糖磷酸化酶
AA-2G
全细胞催化
原文传递
N-脱氧核糖转移酶Ⅱ催化合成克拉屈滨及其定向进化
被引量:
1
3
作者
李京美
李骥璇
+2 位作者
余磊
郑桂兰
王洪钟
《现代生物医学进展》
CAS
2019年第3期401-405,共5页
目的:使用表达N-脱氧核糖转移酶Ⅱ (Nucleoside deoxyribose transferase, NDT)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-NDT,作为催化剂,合成克拉屈滨(Cladribine)。同时构建高通量的酶活筛选体系,利用其改造NDT,以期提高克拉屈滨的合成...
目的:使用表达N-脱氧核糖转移酶Ⅱ (Nucleoside deoxyribose transferase, NDT)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-NDT,作为催化剂,合成克拉屈滨(Cladribine)。同时构建高通量的酶活筛选体系,利用其改造NDT,以期提高克拉屈滨的合成效率。方法:首先用野生型NDT催化克拉屈滨的合成。接着以黄嘌呤氧化酶和辣根过氧化物酶联合作用来检测NDT酶活。最后构建NDT随机突变体库,并筛选出突变体。结果:在10%DMSO的体系中,野生型NDT催化2-氯腺嘌呤合成克拉屈滨的转化率达到93%。同时使用构建的筛选体系在突变体库中筛选到了酶活发生改变的突变体。结论:本研究使用NDT作为催化剂,成功地一步合成了克拉屈滨。同时本研究构建的高通量筛选方法成功应用于改造NDT的酶学性质,为拓展NDT合成核苷类似物的能力提供了一种新的方法。
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关键词
N-脱氧核糖转移酶
克拉屈滨
高通量筛选
原文传递
题名
S-亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达系统的构建及手性胺的合成
被引量:
1
1
作者
李骥璇
余磊
李京美
郑桂兰
王洪钟
机构
清华大学生命科学学院
出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第1期105-111,共7页
基金
国家自然科学基金项目(21476124)
文摘
旨在构建S-亚胺还原酶(S-IRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)在大肠杆菌中的一菌双酶共表达系统,实现辅酶NADPH的再生,高效合成手性仲胺。利用无缝克隆的手段设计构建一种单质粒双启动子共表达系统,以全细胞为催化剂催化手性仲胺S-2-甲基吡咯烷(S-2MP)的合成,并研究温度、pH及有机溶剂对双酶反应的影响。成功构建了S-IRED和GDH的重组共表达质粒,实现了S-IRED与GDH在大肠杆菌中的胞内共表达,以亚胺2-甲基吡咯啉(2MPN)为模式底物,以工程菌全细胞催化手性仲胺S-2MP的合成,在低辅酶添加时催化手性胺的产率和光学纯度均高于95%。该双酶共表达体系的最适温度和pH分别为37℃和pH 8,10%以下的甲醇对双酶反应有正向促进作用。大肠杆菌胞内双酶共表达系统的构建实现了辅酶NADPH的原位再生,降低了亚胺还原酶催化合成手性胺的成本,为手性胺的规模制备奠定了基础。
关键词
亚胺还原酶
葡萄糖脱氢酶
共表达
手性胺
Keywords
imine reductase
glucose dehydrogenase
co-expression
chiral amine
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
TQ460.1 [化学工程—制药化工]
下载PDF
职称材料
题名
蔗糖磷酸化酶全细胞催化AA-2G的条件优化
被引量:
6
2
作者
余磊
李骥璇
王忆茗
郑桂兰
王洪钟
机构
清华大学生命科学学院
复旦大学附属中山医院骨科
出处
《现代生物医学进展》
CAS
2017年第14期2601-2605,共5页
基金
国家自然科学基金项目(21476124)
文摘
目的:使用表达蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-spase,作为全细胞催化剂,合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)。通过反应条件的优化研究,提高AA-2G的收率。方法:分别考察菌体量、缓冲液pH、蔗糖浓度、维生素C浓度、反应时间和温度对AA-2G合成反应的影响,再组合上述最佳条件进行反应。AA-2G的产量使用高效液相色谱法进行定量。结果:最佳反应条件为:菌体量15 mg/mL,缓冲液pH 4.5,蔗糖浓度100 g/L,维生素C浓度175 g/L,反应时间20 h,温度37℃。在此条件下,AA-2G产量达到了35.7 g/L。结论:以蔗糖为底物,使用SPase合成AA-2G的研究报道较少。本研究通过优化此方法的反应条件,让AA-2G的产量得到了大幅提高。同时本研究中成功地采用了大肠杆菌工程菌作为全细胞催化剂,这比传统的使用粗酶液的方法更省时省力,有良好的应用潜力。
关键词
蔗糖磷酸化酶
AA-2G
全细胞催化
Keywords
Sucrose phosphorylase
AA-2G
Whole-cell catalysis
分类号
O629.13 [理学—有机化学]
R-33 [医药卫生]
原文传递
题名
N-脱氧核糖转移酶Ⅱ催化合成克拉屈滨及其定向进化
被引量:
1
3
作者
李京美
李骥璇
余磊
郑桂兰
王洪钟
机构
清华大学生命科学学院
出处
《现代生物医学进展》
CAS
2019年第3期401-405,共5页
基金
国家自然科学基金项目(21476124)
文摘
目的:使用表达N-脱氧核糖转移酶Ⅱ (Nucleoside deoxyribose transferase, NDT)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-NDT,作为催化剂,合成克拉屈滨(Cladribine)。同时构建高通量的酶活筛选体系,利用其改造NDT,以期提高克拉屈滨的合成效率。方法:首先用野生型NDT催化克拉屈滨的合成。接着以黄嘌呤氧化酶和辣根过氧化物酶联合作用来检测NDT酶活。最后构建NDT随机突变体库,并筛选出突变体。结果:在10%DMSO的体系中,野生型NDT催化2-氯腺嘌呤合成克拉屈滨的转化率达到93%。同时使用构建的筛选体系在突变体库中筛选到了酶活发生改变的突变体。结论:本研究使用NDT作为催化剂,成功地一步合成了克拉屈滨。同时本研究构建的高通量筛选方法成功应用于改造NDT的酶学性质,为拓展NDT合成核苷类似物的能力提供了一种新的方法。
关键词
N-脱氧核糖转移酶
克拉屈滨
高通量筛选
Keywords
N-deoxyribosyl transferase
Cladribine
High-throughput screening
分类号
Q-33 [生物学]
Q78 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
S-亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达系统的构建及手性胺的合成
李骥璇
余磊
李京美
郑桂兰
王洪钟
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2019
1
下载PDF
职称材料
2
蔗糖磷酸化酶全细胞催化AA-2G的条件优化
余磊
李骥璇
王忆茗
郑桂兰
王洪钟
《现代生物医学进展》
CAS
2017
6
原文传递
3
N-脱氧核糖转移酶Ⅱ催化合成克拉屈滨及其定向进化
李京美
李骥璇
余磊
郑桂兰
王洪钟
《现代生物医学进展》
CAS
2019
1
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