2型猪链球菌细胞分裂蛋白DivIVA的原核表达及纯化

目的利用原核表达系统制备2型猪链球菌细胞分裂起始因子DivIVA重组蛋白并进行纯化,为研究其在调控细胞分裂中的作用奠定基础。方法以2型猪链球菌05ZYH33全基因组为模板,PCR扩增divIVA基因片段,经BamHⅠ和XholⅠ双酶切后将目的片段连接至表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a-divIVA,经测序鉴定后将重组质粒转化进入表达菌E.coli BL21,以终浓度为0.1mmol/L的IPTG于37℃培养4h,诱导DivIVA蛋白表达。用Ni离子亲和层析柱分离纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测和验证。结果成功构建重组表达质粒pET28a-divIVA,并在E.coli BL21中表达主要以包涵体形式存在的DivIVA蛋白。包涵体蛋白经8mol/L脲变性溶解后经Ni离子亲和层析柱纯化,获得的目的蛋白经SDS-PAGE检测分子质量为36ku,与预期大小相符;经Western blot检测,该蛋白能被相应抗体特异性识别。结论在E.coli BL21中成功表达并纯化了DivIVA蛋白,为研究该蛋白在2型猪链球菌的细胞分裂机制奠定了基础。

2型猪链球菌AdcR蛋白的原核表达

目的表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)调控因子AdcR蛋白,为研究其在2型猪链球菌中调控组氨酸三聚体家族蛋白的作用机制奠定基础。方法通过与相关家族蛋白进行同源性比较,在2型猪链球菌05ZYH33全基因组序列中找出编码AdcR的基因。以AdcR基因序列为基础,利用Primer5.0设计引物,采用PCR扩增AdcR基因,经BamHⅠ和HindIII双酶切后将目的片段通过T4DNA连接酶连接至表达载体pET32a,转化大肠埃希菌E.coli BL21,加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L,37℃诱导4h表达AdcR蛋白,然后利用His亲和层析柱纯化AdcR蛋白。结果通过Blast分析,从2型猪链球菌05ZYH33全基因组序列中找到编码AdcR的编码基因05SSU0109。以合成的特异引物PCR扩增出469bp的AdcR片段,连接原核表达载体pET32a后转化E.coli,经IPTG 37℃诱导4h,成功表达出AdcR蛋白,其分子质量单位为40ku,与理论值相符。经His-Tag亲和层析纯化,获得较高纯度的重组AdcR蛋白。结论在大肠埃希菌中成功表达了可溶性的AdcR重组蛋白,为AdcR在2型猪链球菌中调控组氨酸三聚体家族蛋白作用机制研究奠定了基础。