新型血友病B基因治疗的腺病毒-整合酶嵌合系统的构建及其体外表达鉴定

本研究构建一种既可高效感染靶细胞又能实现安全定点整合入宿主基因组的腺病毒嵌合载体。通过一系列DNA操作构建腺病毒-整合酶嵌合系统,该系统包含两个腺病毒载体:一个携带转基因表达框,表达框内有hFⅨ,红色荧光蛋白编码序列以及attB(phiC31识别位点),表达框两侧各有1个loxP(Cre识别位点);另一个腺病毒载体携带Cre和phiC31基因。同时构建只表达Cre和只表达phiC31的载体作为对照载体。在体外分别用脂质体转染293A细胞,用荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,用RT-PCR鉴定各个基因的表达。结果表明,该腺病毒-整合酶嵌合系统构建成功。体外分别用脂质体转染293A细胞后,可见绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白表达。RT-PCR鉴定表明,该系统能够成功表达各种目的蛋白。结论:成功构建了腺病毒-整合酶嵌合系统,为进一步研究其治疗作用提供良好基础。

糖尿病患者动员后外周血单个核细胞促血管新生能力

目的研究糖尿病患者来源的动员后外周血单个核细胞(M-PBMNCs)移植治疗肢体缺血的疗效,探讨糖尿病患者M-PBMNCs促血管新生能力是否有缺陷及其病理生理机制。方法体外培养内皮祖细胞并鉴定和计数。结扎链脲菌素诱导的糖尿病裸鼠股动脉,造成重度缺血模型后,将来自糖尿病患者、正常人的M-PBMNCs(106)及磷酸盐缓冲液(PBS)分别局部注射到缺血组织中。在第1、3、7、14、21、28天分别用激光多普勒检测局部血流,观察缺血肢体的活动度和缺血情况,用免疫组织化学方法检测缺血部位毛细血管密度和小动脉密度。结果体外内皮祖细胞培养显示糖尿病患者M-PBMNCs中的内皮祖细胞数量相对较少(P<0.05),裸鼠局部缺血组织血流量及血管密度均与糖尿病患者的内皮祖细胞数量呈正相关(R=0.486,P<0.05;R=0.491,P<0.05),而糖尿病患者内皮祖细胞的数量又与其病程呈负相关(R=-0.587,P<0.05)。糖尿病患者M-PBMNCs促进缺血下肢血流和功能恢复的疗效强于PBS组,但不及正常人M-PBMNCs组(P<0.05)。移植了糖尿病患者M-PBMNCs的缺血组织的毛细血管、小动脉密度均低于正常人M-PBMNCs组(P<0.05)。结论糖尿病患者M-PBMNCs的促血管新生能力存在缺陷,使其移植治疗肢体缺血的疗效减低。

60例系统性红斑狼疮并发贫血的分析

为了解系统性红斑狼疮(SLE)并发贫血患者的临床表现、实验室及骨髓检查的特征,对60例SLE并发贫血的患者(贫血组)与同期40例不伴贫血的SLE患者(非贫血组)的临床特点进行对照研究,分析贫血组的临床表现、实验室及骨髓检查的特点。结果显示:贫血组乏力症状比非贫血组明显多见;贫血组Plt减少和C4降低的检出率均明显高于非贫血组;骨髓穿刺发现,贫血组的骨髓嗜酸细胞、原红细胞、早红细胞及中红细胞比例均高于非贫血组;贫血组ANA滴度为1∶320的检出率低于非贫血组;上述指标均有统计学差异。结论:贫血组与非贫血组在临床表现、实验室及骨髓检查有一定的差异。

遗传性蛋白S缺陷症2例报告及文献复习

遗传性蛋白S（PS）缺陷症患者临床较少见。现将我院收治的2例遗传性PS缺陷症病例报告如下，并复习文献，就其发病机制、临床表现及诊断治疗等情况进行讨论.

序列特异性短发夹状RNA逆转白血病多药耐药性研究

本研究旨在构建并筛选MDR1序列特异性短发夹状RNA干扰载体,研究其对K562/A02细胞的影响。采用脂质体介导方法,将含mdr1-sh RNA质粒转入K562/A02细胞,经G418筛选得到稳定表达细胞株,用实时定量RT-PCR和Western blot分别检测干扰后mdr1 mRNA水平及蛋白水平的表达变化,通过CCK8测定干扰后细胞对化疗药的敏感性变化,Rhodamine123外排实验检测P-gp功能的变化。结果发现:与对照组相比,4种MDR1-sh RNA载体均能显著下调P-gp的表达,其中508-526靶位点的shRNA作用效果最好。结论:筛选得到的MDR1-sh RNA载体能够显著下调MDR1的表达,逆转耐药表型,为后续进行的动物实验研究创立了条件。

异基因间充质干细胞输注促进动脉粥样硬化发展

本研究探索间充质干细胞(MSC)输注对动脉粥样硬化的作用。通过体外培养兔骨髓穿刺液获得间充质干细胞。30只新西兰白兔随机分为3组:正常饮食组6只(对照),给予普通饲料饲养;高脂饮食组12只,高胆固醇高脂饲料喂养后静脉注射生理盐水;MSC注射组12只,高胆固醇高脂饲料喂养后静脉注射5×107MSC。分别于实验前,实验第5周,第9周和第13周测体重和空腹血脂水平。实验第13周时处死所有动物,检测动脉粥样硬化斑块和主动脉外膜滋养血管。结果表明,MSC注射组与高脂饮食组相比,主动脉窦斑块面积显著增大(斑块面积占血管面积的百分比分别为(23.35±3.51)%和(11.39±3.08)%,p<0.05),整体主动脉斑块形成明显增多(斑块面积占主动脉面积的百分比分别为(76.64±12.70)%和(57.61±9.00)%,p<0.05)。MSC注射组兔主动脉外膜滋养血管增生明显,毛细血管密度增加。结论:异基因MSC输注促进高脂血症兔动脉粥样硬化斑块进展。采用MSC或包含MSC的细胞进行细胞治疗时应采取策略,减少MSC促进斑块形成的作用。

人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外支持造血能力的比较研究

本研究分离鉴定人骨髓和脐带来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC),比较两种间充质干细胞体外支持长期造血的能力。用密度梯度离心或酶消化方法分离骨髓和脐带间充质干细胞,通过贴壁培养的方法进一步纯化MSC。检测骨髓和脐带MSC的表型以及成脂、成骨分化潜能。通过LTC-IC(long-termculture-initiatingcells)实验,检测骨髓和脐带间充质干细胞体外支持长期造血的能力,并在培养的第3、5、7周分析两种MSC组悬浮细胞的表型。结果表明,骨髓和脐带间充质干细胞体外培养时均呈纺锤形、贴壁生长,2种MSC均表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA-ABC,不表达HLA-DR、CD34和CD45。化学染色证实,2种MSC体外能分化为脂肪细胞和成骨细胞。LTC-IC实验第5周脐带间充质干细胞组CFC(colony forming cell)的产率与骨髓间充质干细胞组比较无统计学差异(p>0.05);第6、7、9周,脐带MSC组CFC的产率均低于骨髓MSC组(p<0.05)。第3、5、7周悬浮细胞表型检测结果显示,随着培养时间的延长,2种MSC组CD34和CD117的阳性率均明显下降,而CD33、CD13、CD11b的阳性率逐渐上升。结论:从人骨髓和脐带组织中成功分离并鉴定出间充质干细胞,脐带间充质干细胞能够在体外支持长期造血,但其造血支持能力弱于骨髓间充质干细胞。

Lman1基因复合杂合突变导致的凝血因子Ⅴ、Ⅷ联合缺乏症

凝血因子Ⅴ和Ⅷ(FⅤ、FⅧ)联合缺乏症(F5F8D)是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病。近年的研究发现,该病病因在于基因lman1或mcfd2的突变。本研究的目的是对1名F5F8D先证者及其家系成员的lman1、mcfd2基因进行扩增、测序,以查找潜在的致病突变。采集了先证者及其父母的外周血样本,进行了凝血功能相关检查,包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、血浆纤维蛋白原(Fg)、FⅤ促凝活性(FⅤ∶C)、FⅧ促凝活性(FⅧ∶C),并提取基因组DNA,通过PCR法对先证者lman1基因的13个外显子及侧翼序列、mcfd2基因的4个外显子及侧翼序列进行特异性扩增,产物经纯化后直接测序,以检测致病突变。根据先证者突变所在位点,选择性扩增其父、母的相应片段,纯化、测序,以便进行家系分析。结果表明:先证者APTT82.2秒、PT19.6秒、TT18.6秒,Fg2.9 g/l,FⅤ∶C 7.1%,FⅧ∶C 18.7%。先证者及其母亲lman1基因第8外显子区出现杂合性单碱基插入c.912_913insA,导致蛋白序列改变p.Glu305fsX20;先证者及其父亲lman1基因11外显子区出现杂合性无义突变c.1366C>T,导致p.Arg456X。结论:先证者lman1基因的复合杂合突变c.912_913insA、c.1366C>T是导致其发病的原因;前者继承自其母,后者继承自其父。这种复合杂合突变的组合方式尚未见有报道。

特发性血小板减少性紫癜患者血清可溶性B淋巴细胞刺激因子的表达

目的研究特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者血清可溶性B淋巴细胞刺激因子（BLyS）的水平，以明确BLyS是否在ITP患者中存在异常的BLyS表达。方法共有41例ITF-患者进入本研究，正常对照由22例年龄性别匹配的健康人组成。血清可溶性BLyS水平以ELISA方法检测。结果未接受治疗的ITP患者BLyS水平（中位数1430pg／mL，534--5787pg／mL）高于正常对照（中位数1120pg／mL，640--2376pg／mL，P=0．006）和ITP接受治疗组（中位数662pg／mL，267～1265pg／mL，P=0．000）。而ITP甲治疗组血清BLyS水平低于正常对照（P=0．001）。血小板计数和BLyS水平之间存在弱的相关关系（Pearson相关系数一0．242，P=0．064）。但BLyS水平与PAIg及免疫球蛋白水平无关。且急慢性ITP患者的BLyS水平之间没有差别（P=0．841）。结论BLyS可能参与了ITP自身免疫的发病过程。但是将血清BLyS水平作为ITP疾病活性标志物尚须谨慎．

一个新的FGA突变导致的遗传性无纤维蛋白原血症家族的分析

遗传性无纤维蛋白原血症是一种以血液中纤维蛋白原完全缺乏为特征的遗传性出血性疾病,是一种常染色体隐性遗传病。为了对1个遗传性无纤维蛋白原血症家族成员进行凝血功能检查及基因分析,采集了该家族3代6人的外周血,应用全自动血凝仪检测活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)及纤维蛋白原(FG,Clauss法),并应用免疫比浊法测定纤维蛋白原抗原。以DNA提取试剂盒提取先证者及其他家族成员DNA,应用PCR法扩增FGA、FGB及FGG基因编码区、侧翼序列及启动子区。通过直接DNA测序方法检测基因突变。结果表明:先证者的父母为3代近亲。先证者FGA基因发现为纯合突变c.934-935insA,造成蛋白序列改变p.Ser312fsX42。先证者父母、祖母、外祖母及姑母均为该突变的杂合子携带者。该突变为国际上首次报道。结论:FGAc.934-935insA纯合突变是先证者发病的原因,该突变是1个新的FGA突变。

DNMT3B基因启动子单核苷酸多态性C46359T与中国北方汉族人群ITP发病的相关性研究

目的探讨甲基化转移酶家族DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性与特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)发病的相关性。方法采用PCR-RFLP结合DNA测序技术检测201例ITP患者及136例正常对照DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性。结果在ITP患者和正常对照中均未检测到C/C基因型。在正常对照中T/T纯合型和C/T杂合型及T、C等位基因的频率分别为97.8%、2.2%、98.9%和1.1%。ITP患者和正常对照之间的基因型和等位基因频率相比无统计学差异(P值分别为0.745和0.747)。ITP患者按年龄和病程分组,儿童组和成人组、儿童急性组和慢性组及成人急性组和慢性组之间的基因型和等位基因的分布均无统计学差异。结论ITP患者和正常对照的DNMT3B基因启动-149位基因型的基因型分布类似;中国北方人群中,DN-MT3B基因启动子-149位基因多态性不能作为ITP易感性的一个预测指标。

脐带间充质干细胞移植对肠辐射损伤模型鼠治疗作用的实验研究

目的探讨脐带间充质干细胞移植对小鼠肠道损伤的治疗作用,为人急性肠型放射病的治疗寻找可靠的供体来源。方法体外诱导观察间充质干细胞的体外多向分化能力。对肠道放射损伤模型鼠移植CM-D iI荧光标记后的人间充质干细胞,组化染色观察肠道粘膜的病理变化,激光共聚焦显微镜观察供体细胞在模型鼠肠道粘膜的定位。结果移植MSC5周后模型鼠的一般状况和肠道病理学表现明显改善,荧光示踪发现移植细胞分布于肠粘膜淋巴组织内和腺上皮细胞间,提示MSC可能参与了肠道粘膜的修复过程。结论脐带间充质干细胞移植可以明显改善模型鼠的肠道病变,有望用于人急性肠型放射病的治疗。

内镜冷光辐射对美蓝染色胃癌细胞SGC7901 DNA损伤的研究

目的 探讨胃镜冷光源照射对美蓝（MB）染色后的胃癌细胞DNA的损伤情况,并探索损伤的发生机制和作用规律.方法 应用单细胞凝胶电泳技术,检测DNA损伤情况;Annexin VFITC/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡;采用荧光探针DCFH-DA,进行细胞内活性氧（ROS）检测.结果 冷光照射MB染色的SGC7901细胞后,其DNA损伤程度较未照射组增加（F=8.39,P＜0.05）,损伤严重程度与光照时间呈正相关,光照停止则有损伤修复,照射后细胞较未照射细胞出现明显凋亡（x2=7.71,P＜0.05）;同时,经照射后的细胞内ROS高于未照射组（F=34.11,P＜0.01）.结论 美蓝色素内镜的冷光辐射可造成SGC7901细胞的DNA损伤,并诱发细胞凋亡,其作用机制与光化学反应激发产生的过量ROS有关.

消化内镜检查中使用的染色剂安全吗

随着消化内镜的普及和内镜诊治技术的提高，对于疾病诊断准确性和及时性的要求也在不断提高，于是上世纪末色素内镜（染色内镜，chromocndoscopy）技术在日本应运而生，并在一些大型医院逐渐普及。由于该技术开展较晚，针对其临床应用的基础研究还不多见。

抗脐带间充质干细胞表面分子噬菌体ScFv抗体库的构建及初步鉴定

目的:利用噬菌体展示技术构建抗脐带间充质干细胞表面分子噬菌体ScFv抗体库。方法:收集P3代培养的UC-MSCs免疫BALB/c小鼠,提取其脾细胞总RNA,RT-PCR扩增全套VH和VL基因片段,将其先后克隆入噬菌粒pSEX81中,构建成完整的噬菌体ScFv抗体库。结果:构建的噬菌体ScFv抗体库的库容为2×107cfu,ScFv插入重组率为93%,BstN1酶切图谱呈不同多样性。ScFv抗体库经3轮初步筛选后插入重组率达100%,3个克隆出现了相同的酶切图谱,并且随着筛选次数的增加,输出/输入比明显提高,这说明抗体库得到了特异性富集。结论:成功地构建了抗脐带间充质干细胞表面分子噬菌体ScFv抗体库,这为将来筛选特异性抗体和进一步用于间充质干细胞表面特异性分子研究奠定了坚实的基础。

高压尾静脉注射和位点特异性整合介导的人凝血因子Ⅸ基因治疗血友病B小鼠

目的 通过高压尾静脉注射将携带attB和人凝血因子Ⅸ（hFⅨ）的质粒与表达phiC31的质粒共同导入血友病B小鼠肝脏细胞,检测目的 质粒能否整合入小鼠基因组并持续表达.方法 ①构建表达hFⅨ并携带attB核心序列的真核表达载体attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP,并在体外验证该载体能否表达目的 基因.②用高压尾静脉注射法将该载体与表达phiC31的质粒CMV-int共注入血友病B小鼠,attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP单独注射为对照.③ELISA的方法检测hFⅨ在其体内的表达 用出血时间评价血友病小鼠出血症状是否改善 用巢式PCR检测attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP是否整合到基因组的整合热点mpsL1（mouse pseudo-site from liver 1）位点.结果 经鉴定,attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP载体构建成功,并在体外表达hFⅨ.高压尾静脉注入血友病B小鼠24 h后,hFⅨ血清水平达到最高值为（1533±239）ng/ml,此时小鼠的出血症状明显改善.但是不论是否与CMV-int共注射,此后hFⅨ水平迅速下降,在注射后10 d内降到本底水平.巢式PCR的结果证实,attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP整合到小鼠肝脏基因组的mpsL1位点.结论 phiC31可以将34 bp的attB最短序列整合到小鼠基因组的整合热点mpsL1 由CMV启动hFⅨ的能够瞬间高表达并有效改善血友病小鼠的出血症状 但是外来DNA进入细胞后,无论是否整合到基因组均被迅速沉默,说明肺脏和肝脏对整合入基因组的CMV启动子表达调控的机制不尽相同,因此对用于基因治疗的裸DNA进行改进使其适合在靶器官表达是十分必要的.