猪兔鼠肾生物支架制备及体外细胞共培养探究

目的灌注制备家猪、新西兰白兔、SD大鼠肾去细胞生物支架,探究三种肾支架对共培养种子细胞HEK的影响。方法取健康成年家猪10头、新西兰白兔28只、SD大鼠28只,分别将取出的肾脏随机均等分为正常组和支架组,支架组由肾动脉依次灌入肝素、1%Triton X-100和1%SDS溶液完成去细胞化。两组肾分别作组织形态学鉴定并检测机械力学性质。去细胞支架作组织爬片与人胚肾上皮细胞共培养,观察细胞在支架爬片上的生长状况,免疫荧光检测人胚肾上皮细胞PCNA及DAPI表达量作灰度分析。结果家猪、新西兰白兔、SD大鼠肾脏经灌注去细胞后HE核染色阴性,Masson染色显示胶原蛋白阳性,Collagen I和Collagen IV荧光染色阳性,电镜扫描可见去细胞支架内蜂窝状孔洞结构,并可见典型的肾小球龛样结构;支架组弹性模量与正常组肾弹性模量差异无显著性,支架组PCNA/DAPI值均高于空白对照组,而三种支架组之间PCNA/DAPI值无显著性差异。结论本研究灌注去细胞方法可去除家猪、新西兰白兔、SD大鼠肾内的细胞及细胞核,保留细胞外基质,维持细胞外基质的三维空间结构和机械力学强度,是一种可靠有效的制备三者肾去细胞生物支架方法,灌注制备的去细胞支架均可提高异种共培养人胚肾上皮细胞HEK的增殖活性,且这种提高作用在家猪、新西兰白兔和SD大鼠之间并无物种差异性。

京尼平交联大鼠肾去细胞生物支架提高支架生物学性能的实验研究

目的通过京尼平交联大鼠肾去细胞生物支架,提高支架的生物学性能。方法取250 g左右的健康SD大鼠80只,分为正常组、未交联支架组、戊二醛交联支架组和京尼平交联支架组。游离大鼠肾、肾动脉,连接蠕动泵,经PBS灌注去血后得到的肾作为正常组。其余大鼠肾依次灌入肝素化PBS溶液、1%TritonX-100、1%十二烷基硫酸钠(SDS)、去离子水,完成大鼠肾去细胞生物支架制备。戊二醛交联支架组继续灌入0.625%戊二醛(GA)1500 mL;京尼平交联支架组浸入0.5%的京尼平溶液于37℃恒温箱中行化学交联24 h;未经戊二醛或京尼平交联的肾去细胞支架作为未交联支架组。对4组肾分别作HE、Masson、免疫荧光染色及电子显微镜扫描,观察支架组织形态学及超微结构改变;力学拉伸试验检测机械力学性能。结果 SD大鼠肾支架经京尼平交联后,HE、Masson染色显示胶原纤维排列更加紧密有序,肾小球处的纤维呈聚集状,Collagen Ⅰ和Collagen Ⅳ荧光染色增强,电镜扫描可见交联后的去细胞支架内蜂窝状孔洞结构更加立体,并可见典型的肾小球龛样结构轮廓更加清晰;交联组肾弹性模量较支架组明显增强。结论京尼平交联大鼠肾支架能提高支架的生物学性能有助于为后期细胞植入和器官再生。