氟乐灵对大鼠肝、肾微粒体酶的影响

目的 研究除草剂氟乐灵对大鼠肝、肾微粒体酶的作用。方法 采用体内和体外方法 ,研究了氟乐灵对大鼠肝、肾微粒体酶影响以探讨其毒作用及可能机制。结果 ①连续灌胃 5天后氟乐灵 ( 5 0 0mg/kg)能诱导肝微粒体细胞色素P45 0和苯胺羟化酶 (AH )活性 (P <0 0 5 ) ,明显诱导细胞色素b5含量和NADPH 细胞色素C还原酶活性 (P <0 0 1) ,同时使肝重、肝微粒体蛋白含量显著增加。体外实验中 ,氟乐灵在高浓度 ( 2 5× 10 -4 mol/L)条件下可明显诱导肝细胞色素P45 0 (P <0 0 1)。对AH的酶动力学研究表明氟乐灵可增加AH的最大反应速度 (Vmax) ,对其米氏常数 (Km)无明显影响 ,可见氟乐灵对AH的诱导不是通过改变AH与底物的亲和力实现的 ,而可能与促进蛋白合成有关。②体内实验中氟乐灵可使肾微粒体NADH 细胞色素C还原酶活性显著增加 (P <0 0 5 ) ,而对肾细胞色素P45 0、b5以及NADPH 细胞色素C还原酶无明显影响。结论 氟乐灵可明显诱导大鼠肝微粒体混合功能氧化酶系。

人DNA聚合酶β高表达细胞HLFβ的细胞学分析

目的 获取人HLF细胞内稳定高表达人DNA聚合酶beta(pol β) ,并对pol β稳定高表达细胞的细胞学特征进行分析。方法 使用构建的人pol β全长cDNA的绿色荧光蛋白GFP表达载体pEGFP Cl β ,转染人HLF细胞 ,经G418筛选 ,获得单克隆的pol β稳定高表达的细胞HLFβ ,并对HLFβ细胞的细胞增殖、细胞周期、自发突变率、恶性增殖能力等特征进行分析。结果 Western印迹显示 ,HLFβ细胞的pol β蛋白表达稳定 ,较空载体转染对照细胞高 60 %以上 ,且在不同代间表达稳定。HLFβ细胞增殖能力较对照细胞增强。HLFβ细胞自发突变率略有增加 ,但与对照细胞的差异无显著性 ,细胞周期分布及细胞恶性程度亦无明显改变。结论 该研究成功获得人pol β稳定高表达细胞HLFβ ,在正常生理状况下 ,pol β的高表达对细胞周期、自发突变和恶性增殖能力未见明显影响。

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 。

铈对培养肝细胞的影响

应用流式细胞术研究了稀土离子对大白鼠原代肝细胞和肝癌细胞的影响．结果表明，稀土离子可以增加原代肝细胞内ＤＮＡ含量，促进细胞增殖，改变肝细胞周期时相，减少正常肝细胞凋亡，诱导肝癌细胞凋亡；钙调素也能促进细胞内ＤＮＡ含量的增加。

广东省放射工作人员健康状况调查

目的 了解长期小剂量电离辐射对放射工作人员健康的影响 ,为保障其工作者的健康和改进防护措施提供依据。方法 通过职业流行病学现况调查的方法 ,按照广东省放射工作人员职业健康体检规范要求 ,对 2 0 0 2年广东省999例放射工作人员的职业健康状况进行分析。结果 随着工龄增加 ,放射工作人员眼科检查的异常率增加。血液常规检查和细胞遗传学指标 (外周血淋巴细胞微核率 )及眼晶状体混浊率 ,部分组间指标差异有统计学意义。男性微核率的异常率 >15年组是 <5年组的 5 2倍 ,是 5～ 15年组的 1 4倍 ,女性微核率异常率 >15年组是 <5年组的 3 3倍 ,是 5～15年组的 2 5倍。结论 加强放射卫生监督管理 ,重点保护暴露工龄较长的放射工作人员 。

静态负荷对大鼠离体骨骼肌能量代谢的影响

目的 探讨线粒体钙浓度 (MCC)和能量代谢变化之间的相互关系以及细胞内钙浓度升高的来源。方法 建立不同Ca2 + 浓度 (3mmol/L、 1. 5mmol/L)及不同培养时间 (2h、 4h)条件下大鼠离体骨骼肌被动牵拉培养的模型 ,测定线粒体钙浓度 (MCC)、ATP酶活性和乳酸 (LA)含量。结果 MCC在各实验中实验组与对照组相比均有显著性增加 (P <0 . 0 5 ) ;LA含量在 3mmol/LCa2 + 培养液中培养 2h条件下有显著增加 (P <0 . 0 5 ) ,在其他实验中均无显著性变化 ,Na+ - K+ ATPase、Ca2 + - ATPase亦无显著性变化。结论 MCC在牵拉负荷条件下有显著增加 ;胞内钙平衡紊乱可能发生在能量代谢障碍之前 ,并成为肌肉损伤的初始因素。

重金属的肾上腺皮质毒性与机制研究 Ⅱ.氯化镉影响肾上腺皮质激素合成分泌机制的整体实验研究

目的 研究镉对豚鼠肾上腺皮质细胞形态与功能影响的毒作用特点及可能的机制。方法选用健康雄性豚鼠以４５ μｇ／ｋｇ 和９０ μｇ／ｋｇ 氯化镉腹腔注射染毒，测定血皮质醇、醛固酮及促肾上腺皮质激素（ＡＣＴＨ，放免法） 、血清胆固醇（ 酶联法） 、血和组织镉含量（ 原子吸收法） 和一氧化氮（ 硝酸还原酶法） 。结果 两个染镉组豚鼠血及肾上腺镉含量增加，ＡＣＴＨ 降低，呈剂量效应关系，高剂量组皮质醇略呈增高，其余波动在正常范围。肾上腺组织ＮＯ 水平降低，亦呈剂量依赖方式。结论 镉直接作用于垂体的同时可能引发肾上腺皮质应激反应，且肾上腺皮质ＮＯ 合成减低。

氯化镉影响肾上腺皮质细胞分泌功能的实验研究

目的 探讨ＣｄＣｌ２ 对肾上腺皮质细胞分泌功能、细胞［Ｃａ２ ＋ ］ｉ 调控和能量代谢的毒作用，为深入了解金属内分泌毒性机制提供依据。方法 体外分离培养原代豚鼠肾上腺皮质细胞，采用Ｆｌｕｏ － ３／ＡＭ 和Ｆｕｒａ－ ｒｅｄ／ＡＭ 联合标记、流式细胞术测定细胞［Ｃａ２＋ ］ｉ 变化，化学发光法测定ＡＴＰ 水平，ＲＩＡ 法测定培养细胞皮质醇分泌水平。结果 ①ＣｄＣｌ２ 可浓度依赖性地抑制肾上腺皮质细胞分泌皮质醇的功能，且随时间延长抑制效应愈趋明显，呈现明显的剂量效应和时间效应关系，剂量和时间对抑制效应存在交互作用；②细胞［Ｃａ２ ＋ ］ｉ 随ＣｄＣｌ２ 浓度增加而持续上升，表现出剂量效应关系。③细胞ＡＴＰ 水平随ＣｄＣｌ２ 浓度增加而降低，有明显的剂量效应和时间效应关系，而且存在交互作用。结论 一定浓度ＣｄＣｌ２ 对肾上腺皮质细胞［Ｃａ２＋ ］ｉ 调控、能量代谢和肾上腺皮质激素合成分泌具有直接毒作用。

密闭空调环境对机体免疫功能的影响

目的 通过作业场所职业卫生调查 ,研究密闭工作环境对人体健康的影响。方法 对 90名空调环境暴露工人和 5 4名非空调环境对照工人进行一般情况调查 ,检测血清IgG、IgM、IgA ,补体C3 、C4和溶菌酶等免疫指标 ,同时对比两组车间空气质量状况。结果 观察组空调环境中 ,甲醛、CO2 浓度及噪声强度均显著高于对照组 (P <0 0 5 ) ,负离子显著低于对照组 (P <0 0 5 )。观察组血清IgG、IgM、IgA ,补体C3 、C4均低于对照组 (P <0 0 1) ,溶菌酶差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论 空调环境中负离子浓度低 ,空气质量恶化 ,可能对作业人群的免疫功能造成一定影响 ,使其有降低的趋势。

重金属的肾上腺皮质毒性与机制研究Ⅰ.铅对肾上腺皮质激素合成与调控的毒作用

目的研究铅对豚鼠肾上腺皮质细胞形态与功能影响的毒作用特点及可能的机制。方法选用健康雄性豚鼠以３０ｍｇ／ｋｇ醋酸铅腹腔注射染毒，取血测定皮质醇、醛固酮及ＡＣＴＨ（放免法）、血清胆固醇（酶联法）、血铅和组织铅含量（原子吸收法）和一氧化氮（硝酸还原法）。结果染铅组豚鼠血及组织达到一定铅负荷，激素合成前体胆固醇含量降低、血醛固酮略升而皮质醇和其调控激素ＡＣＴＨ呈降低的趋势，光镜和电镜见肾上腺皮质细胞线粒体与内质网的损伤。结论铅进入机体产生应激反应，同时对束状带产生特异性损伤导致糖皮质激素合成障碍，皮质细胞ＮＯ合成不足可能在铅内分泌毒性过程起重要作用。

hMTH1缺陷细胞株建立及生物学特性研究

目的 建立hMTH1缺陷细胞株 ,观察该缺陷所引起的生物学效应。方法 用hMTH1基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体 (pEGFP C1 T)转染人胚肺成纤维细胞 (HLF) ,半定量RT PCR鉴定其对hMTH1基因mRNA表达的抑制效果。同时观察转染细胞生长形态 ,绘制生长曲线 ,用流式细胞术观察细胞周期 ,软琼脂培养法鉴定恶性程度。结果 pEGFP C1 T载体在转染细胞内可较稳定表达 ,缺陷细胞株hMTH1mRNA表达水平比HLF细胞下降了 47%。hMTH1缺陷细胞生长形态无明显变化 ,细胞倍增时间为 0 89d ,与HLF细胞 0 93d接近 ,细胞周期各时相未受影响 ,软琼脂培养未见细胞集落。结论 hMTH1缺陷细胞株成功建立 ,该缺陷不足以单独引起可观察的生物学效应。

中国广东汉族人群核苷酸修复基因hMTH1遗传多态性研究

为研究中国南方汉族人群核苷酸修复基因hMTH1遗传多态性,应用聚合酶链反应 单链构象多态性技术检测172名健康人外周血白细胞hMTH1基因启动子及全部5个外显子多态性,并进行DNA测序。结果发现hMTH1基因启动子及外显子1序列保守,未见突变;外显子2第73位碱基存在T→C杂合型突变,基因型TT和TC频率分别为93 02%、6 98%,等位基因T和C频率分别为96 51%、3 49%;外显子3第45位遗传密码存在T→C杂合型突变,基因型TT和TC频率分别为95 35%、4 65%,等位基因T和C频率分别为97 67%、2 33%,该多态性为首次发现;外显子4第83位遗传密码存在G→A杂合型突变,基因型GG和GA频率分别为89 53%、10 47%,等位基因G和A频率分别为94 77%、5 23%;外显子5第119位氨基酸遗传密码存在C→T杂合型突变,基因型CC和CT频率分别为95 93%、4 07%,等位基因C和T频率分别为97 97%、2 03%。

DSB修复基因hKu70反义RNA真核表达载体构建

目的 构建人DNA双链断裂 (DSB)修复基因hKu70反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K ,为以后的hKu70基因功能和毒理学研究提供实验材料。方法 提取人胚肺成纤维细胞 (HLF)总RNA ,逆转录酶 多聚酶链式反应 (RT PCR)扩增hKu70基因cDNA保守序列 ,经与pGEM T载体连接、筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后 ,将纯化的hKu70基因cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP C1中 ,筛选、克隆、抽提质粒 ,从而构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K。结果 经RT PCR获得 467bp含限制性内切酶位点的DNA片段 ,T载体克隆后经双酶切、测序 ,确定该片段为hKu70基因cDNA ,进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K ,并双酶切 ,测序确证。结论 成功构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K ,为建立该基因低表达细胞株。

高浓度锌对雄性大鼠生殖系统的影响

目的:探讨高浓度锌对雄性大鼠生殖系统的影响.方法:分别以12、120、240mg/kg三个剂量的硫酸锌,给大鼠灌胃染毒60天,观察大鼠生殖系统的变化.结果:各剂量组锌对雄性大鼠的生殖系统产生不同程度的影响,低、中、高各剂量组大鼠精子数目和活动度分别为(93.35±23.62)×109/L、(61.92±10.01)%;(75.20±20.26)×109/L、(56.62±11.46)%和(46.45±18.84)×109/L、(42.85±10.49)%,与阴性对照组(72.60±22.72)×109/L、(58.85±8.85)%比较,低剂量组精子活动数目和活动度显著提高,高剂量组显著降低,且有统计学意义(P＜0.05).高剂量组大鼠睾丸有较明显的病理学损伤.结论:高浓度锌对雄性大鼠生殖有损伤作用.

线粒体DNA氧化损伤热点的形成及其修复速率的比较

本研究旨在探讨线粒体DNA氧化损伤热点的形成是否与该点DNA修复速率慢有关 .BRL 3A细胞暴露于 5 0mmol·L- 1过氧化氢 (H2 O2 ) 30min后 ,分别于 0 ,1,4及 2 4h收获细胞 ,应用连接介导聚合酶链反应分析线粒体DNA氧化损伤热点的修复百分率并与线粒体DNA氧化损伤的总修复百分率比较 ,通过狭缝印迹法 ,比较了各时间点细胞内p5 3/线粒体DNA比率来验证其修复的可靠性 .结果表明 :在 4及2 4h ,热点的修复速率分别为 5 .2 %和 4 2 .1% .而线粒体DNA的总修复百分率分别为 76 .9%和 84 .1% ,后者与前者相比 ,其修复速率快 1～ 14倍左右 .应用狭缝印迹发现各时间点细胞内p5 3/线粒体DNA比率无明显变化 .因此 ,线粒体DNA氧化损伤热点的形成与其修复速率较慢有关 .

无义突变通读活性检测方法的研究进展

研究发现,30%人类致病基因突变属无义突变,基因编码区发生的无义突变可致蛋白翻译在无义突变位点提前终止,导致蛋白功能缺失,引起包括遗传病、肿瘤在内的众多疾病。少数化合物具有无义突变通读作用,可诱导全长蛋白翻译而恢复部分功能,是一种前景广阔的潜在治疗药物。筛选新型无义突变通读剂至关重要,这些工作有赖于通读活性检测方法的发展和完善。目前通读剂活性检测方法主要包括两大类型,原理都是基于蛋白截断试验(protein truncation test,PTT)或报告基因系统。本文较全面地回顾了无义突变通读活性检测方法的发展及最新进展,为高通量筛选方法的建立提供参考,从而进一步推动新型通读剂的筛选工作,发现具有临床药物潜力的候选化合物,用以治疗无义突变所致众多疾病。

DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株的建立

目的 建立并鉴定DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株 ,用于研究hMSH2基因的作用机制及其缺陷与肿瘤发生的关系。方法 运用基因工程的方法获得hMSH2cDNA片段 ,并反向克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上 ,随后将构建好的hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体转染入人胚肺成纤维细胞 (HLF) ,使之在HLF中表达 ,用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hMSH2基因的表达水平。结果 构建了hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体 ,并在真核细胞成功表达 ;hMSH2酶缺陷细胞株hMSH2基因的蛋白表达水平下降了 4 4 %。结论 hMSH2缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hMSH2基因功能研究提供了一种有效手段。

人pol-β高表达对细胞应对DNA损伤反应时的影响

目的探讨DNA聚合酶beta（pol-β）高表达对细胞应对遗传损伤反应的影响。方法转染筛选人pol-β稳定高表达的细胞株HLFβ，以甲基甲磺酸（MMS）染毒，从DNA损伤、细胞周期及诱发突变等方面，研究pol-β在细胞应对DNA损伤时的作用。结果经过筛选获得人pol-β稳定高表达的细胞HLFβ，在MMS中、高剂量组（0．5～0．8mmol／L），MMS对HLFβ细胞的DNA损伤反应明显低于对照细胞，差异有统计学意义（P〈0．05）。细胞周期分析显示，MMS染毒后2种细胞在G2期均有阻滞现象。而在HLFβ组，当MMS剂量增加到0．5mmol／L时，除呸期阻滞外，49．0％的细胞被阻滞在G1期，而相同剂量下对照组只有20．1％阻滞于G1期。此外，在MMS 0．5mmol／L组，HLFβ与HLFC相比，诱发突变率从4．5×10^-6增加到8．2×10^-6差异有统计学意义（P〈0．05）。结论pol-β的高表达对细胞应对MMS的细胞毒性和遗传毒性具有一定的保护作用，其效应与HLFβ细胞周期G1期的阻滞有一定关系。但由于pol-β合成DNA的保真度较低，高表达的pol-β也增加了细胞突变的概率，可能产生远期遗传毒性。

经典途径IKKα和IKKβ在胰岛素抵抗和2型糖尿病中的作用机制及药物治疗

胰岛素抵抗、肥胖病和2型糖尿病与慢性炎症有着密切关系,慢性炎症中促炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)等通过激活经典的IKKα,IKKβ途径和非经典的IKKε,TDK1途径,激活NF-кB途径,引起胰岛素抵抗、肥胖病和2型糖尿病,其中IKKβ在经典的IKKα和IKKβ途径中起着主导作用。阻断IKKα和IKKβ途径,可显著减少炎症、增加胰岛素敏感性,降低体重和减少2型糖尿病。因此,阻断IKKα和IKKβ途径,可作为研究治疗胰岛素抵抗、肥胖病和2型糖尿病的一个新的作用靶点。