带3蛋白C端和血型糖蛋白A相互作用及其抗原相关性的研究

采用高效液相色谱法分离鉴定了红细胞膜蛋白质跨膜域的亲水性肽链 ,结果显示血型糖蛋白A (GPA)Lys10 1～Asp130与带 3蛋白有相关性 .为进行深入研究 ,采用RT PCR方法从K5 6 2细胞中扩增了 410bp的GPA基因 ,分别克隆到酵母双杂交BD端表达质粒和杆状病毒转移载体上 .同时 ,以含有带 3蛋白全长基因的质粒为模板扩增了 34 8bp的带 3蛋白C端基因 ,将其克隆到酵母双杂交AD端表达质粒 .经酵母双杂交营养缺陷培养选择和 β半乳糖苷酶检测证实GPA与带 3蛋白之间存在相互作用 .GPA表达产物分别经抗带 3蛋白和抗GPA抗体进行蛋白质印迹分析 ,表明二者具有免疫交叉反应 .上述结果表明带 3蛋白与GPA在结构与功能上存在着密切联系 .

表达血型糖蛋白A和带3蛋白膜段基因的杆状病毒转移载体的构建

用RT-PCR方法从K562细胞中扩增了410 bp的血型糖蛋白A基因,以含有带3蛋白全长基因的质粒为模板扩增了1.5kb的带3蛋白膜段基因,分别克隆到pMD18-T载体上,筛选到阳性重组子pMD18-T-GPA和pMD18-T-B3m。再将基因分别亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中,随机筛选得到重组病毒转移载体pBacGPA和pBacB3m,为表达和进一步研究血型糖蛋白A和带3蛋白的相互关系打下基础。

酵母双杂合系统AD端阴离子交换蛋白C-末端表达质粒的构建

利用 PCR方法 ,从阴离子交换蛋白 1(AE1)全长 c DNA中扩增出约 35 0 bp c末端 c DNA片段。测序后将其克隆至 p GADT7载体上。用醋酸锂法将构建好的 p GADT7- AE1- c-末端转染酵母菌 AH10 9,观察其在选择性培养基上的表达情况。结果表明 ,获得了 35 0 bp AE1c-末端 c DNA,p GADT7- AE1- c-末端对酵母无毒性 ,不能激活检测基因 。