胡黄连苷Ⅱ通过增强自噬改善Aβ模型小鼠的学习和记忆功能

目的:探究胡黄连苷(picrosideⅡ,PicrⅡ)对体内外阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease,AD)模型的学习和记忆功能及自噬相关机制。方法:通过Western blot检测在PicrⅡ(12.5~400μmol/L)对AD细胞模型中β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)、β-位点淀粉样前体蛋白切割酶1(β-site APP-cleaving enzyme 1,BACE1)、早老素蛋白1(presenilin 1,PS1)和APP羧基末端片段(carboxyl terminal fragment ofβ-amyloid precursor protein,CTF)蛋白表达影响,以及PicrⅡ和氯喹(Chloroquine,CQ)(50μmol/L)或巴佛洛霉素(bafilomycin A1,BafA1)(10μmol/L)共处理后对APP、BACE1、PS1、C99、螯合体1(sequestosome 1,p62)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、泛素化蛋白的表达影响;利用免疫荧光分析自噬通量;后期构建β-淀粉蛋白(amyloidβ,Aβ)模型小鼠,分为WT+PBS组、WT+PicrⅡ组、Aβ+PBS组和Aβ+PicrⅡ组(20 mg/kg),通过Morris水迷宫实验验证小鼠学习和记忆功能,并检测小鼠海马蛋白中P62与LC3蛋白水平。结果:Western blot显示:与对照组相比,PicrⅡ(50μmol/L)可显著降低APP(60.46±7.97,P=0.049)及相关代谢产物蛋白水平,并降低P62[(65.31±3.51)%,P=0.041]水平,增加LC3Ⅱ[(162.01±12.24)%,P<0.001]水平,并且在CQ作用下,PicrⅡ可降低P62[(147.24±10.69)%,P<0.001]及LC3水平[(826.23±39.18)%,P<0.001];自噬通量分析显示:与对照组相比,PicrⅡ增加总荧光数(23.24±1.50,P<0.001)和红色荧光数(3.52±0.33,P<0.001);行为学结果显示:与WT+Aβ组相比,Aβ+PicrⅡ组学习(F=17.25,P<0.001)与记忆能力(F=6.627,P<0.001)提高,且小鼠海马蛋白中Aβ+PicrⅡ组P62降低[(176.66±11.47)%,P=0.023],LC3Ⅱ升高[(81.20±3.69)%,P<0.001]。结论:PicrⅡ可通过促进自噬体-溶酶体融合和提高自噬通量增强自噬,从而促进Aβ清除并改善其引起的学习和记忆障碍。

卵巢切除对APP/PS1双转基因小鼠脑内老年斑及自噬的影响

目的研究雌激素对APP/PS1双转基因小鼠脑内老年斑及自噬的影响,探讨雌激素缺乏导致阿尔茨海默病(AD)的病理机制。方法将3月龄雌性APP/PS1双转基因AD模型小鼠分为卵巢切除组与假手术组,术后2个月采用免疫组化染色及透射电镜观察两组小鼠脑内老年斑及自噬功能的变化,同时检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达情况。结果免疫组化结果显示,与假手术组相比,卵巢切除组小鼠脑内老年斑显著增加,分布更广,自噬相关蛋白LC3、Beclin-1阳性神经元数量均显著下降。电镜观察可见,与假手术组相比,卵巢切除组小鼠海马神经元及突起肿胀明显,暗神经元增加,神经元突起周围自噬小泡显著增多。结论雌激素缺乏可导致自噬泡成熟受阻、活性降低、自噬功能减弱,从而导致AD病理改变加重。

慢性脑缺血对APP/PS1双转基因小鼠行为学及脑组织形态学的影响

目的:探讨慢性脑缺血对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型小鼠的行为学以及脑组织形态学的影响。方法:将20只3月龄APP/PS1 AD模型小鼠随机分成2组,每组10只,对其中一组采用改良的双侧颈总动脉狭窄术,另一组双侧颈总动脉未结扎小鼠为假手术对照组。术后1个月分别采用Morris水迷宫、组织学和免疫组化染色,检测模型组和假手术组小鼠行为学的改变、海马区神经细胞形态学的改变、海马区神经细胞内Neu N和APP及Aβ的表达变化。结果:行为学实验结果:(1)可视平台下,2组小鼠找到平台的时间(t=1.31,P=0.19)及搜索的平均路程(t=0.04,P=0.97)无显著差异;(2)隐蔽平台下,脑缺血模型组小鼠(26.39±1.37)找到平台的时间较假手术对照组(20.19±1.19)明显延长(t=3.44,P=0.00);(3)空间探索实验中,经过平台的次数,脑缺血模型组小鼠(3.11±0.37)较对照组(4.25±0.34)明显减少(t=2.24,P=0.03)。HE染色:脑缺血模型组小鼠海马内神经细胞明显肿胀、细胞排列紊乱。免疫组化结果:脑缺血模型组小鼠海马内Neu N阳性神经元数量(93.40±10.44)较对照组(156.20±24.16)显著减少(t=2.39,P=0.04);而APP-阳性神经元(t=2.35,P=0.047)、Aβ40-阳性神经元(t=2.54,P=0.04)以及Aβ42-阳性神经元(t=2.476,P=0.04)较假手术组明显增加。结论:本实验新建立的改良双侧颈总动脉狭窄术能导致小鼠慢性脑缺血;慢性脑缺血可加速APP/PS1双转基因AD模型小鼠的病理进程。

MKP-1在APP/PS1双转基因小鼠脑内的分布及表达

目的研究丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)在APP/PS1双转基因小鼠脑中的分布和表达,探索MKP-1与阿尔茨海默病(AD)的关系。方法选取3、8、12月龄的APP/PS1双转基因雄性小鼠(AD小鼠)各5只,以同窝野生型雄性小鼠作为正常对照(n=5)。采用免疫组化和Western blotting检测MKP-1在小鼠脑内的分布和表达情况。结果免疫组化检测显示,MKP-1在AD小鼠脑内广泛表达,包括大脑皮质、海马、丘脑等;3月龄AD小鼠脑内MKP-1阳性神经元数目(8824±1397)明显高于8月龄AD小鼠(5278±1764,P=0.008),且8月龄AD小鼠阳性神经元数目明显高于12月龄AD小鼠(2864±1464,P=0.046)。Western blotting结果与免疫组化结果一致(F=18.052,P=0.003)。与8月龄AD小鼠比较,同窝野生型小鼠脑内MKP-1阳性神经元数目(10 121±3657)明显增高(P=0.028)。8月龄AD小鼠脑内MKP-1可以染出斑块,且斑块数目(6.00±4.06)明显低于4G8所染的老年斑数目(25.60±5.86,P=0.000),免疫荧光共聚焦观察到二者有部分共表达现象。结论 MKP-1在AD小鼠脑内的表达随年龄增长而下调,且可能与老年斑的形成及AD的发生相关。

大麻素HU-210对APP/PS转基因小鼠学习记忆及脑内老年斑的影响

目的:研究大麻素HU-210对APP/PS转基因小鼠空间学习记忆能力和脑组织中老年斑表达变化的影响。方法:3.5月龄APP/PS转基因小鼠随机分为HU-210处理组和生理盐水对照组,每组10只,用大麻素HU-210[100μg/(kg·次)]和等量生理盐水分别腹腔注射1个月。应用Morris水迷宫和恐惧实验检测各组小鼠学习记忆能力的变化;采用免疫组化染色以观察小鼠脑内老年斑的变化。结果:水迷宫实验显示,与对照组相比,HU-210处理组小鼠找到平台的潜伏期及搜索路程显著缩短;HU-210处理组小鼠穿越平台次数(5.40±1.52)明显高于对照组小鼠(1.60±1.14,P<0.01);恐惧实验显示,电击后HU-210处理组小鼠出现Freeze次数(电击后即刻:38.30±15.16;电击后24 h:99.89±5.71)明显高于生理盐水对照组(电击后即刻:17.84±5.33;电击后24 h:56.00±4.78,P<0.01)。免疫组化显示,与对照组(3.90±2.51)相比,HU-210处理组小鼠脑内老年斑数量(9.70±5.67)明显减少(P<0.05)。结论:在老年斑形成初期使用大麻素可明显减少痴呆模型小鼠脑内老年斑的形成,从而改善痴呆模型小鼠的认知功能。

APP/PS1双转基因小鼠视网膜内β-淀粉样蛋白及星形胶质细胞的变化

目的 通过比较阿尔茨海默病（AD）模型小鼠和野生型小鼠视网膜内病理改变情况,探讨AD患者视觉异常的原因. 方法 取3月龄、12月龄AD模型小鼠及同窝野生型正常小鼠各10只,采用免疫组化的方法比较2种小鼠视网膜内β-淀粉样蛋白前体蛋白（APP）和β-淀粉样蛋白（Aβ）的表达变化;应用视网膜铺片结合免疫荧光染色的方法比较2种小鼠视网膜内星形胶质细胞的形态及数量变化（通过检测其标志物胶质纤维酸性蛋白）. 结果 APP在不同月龄AD模型小鼠和野生型小鼠视网膜内均有表达,但AD模型小鼠视网膜内的表达明显强于同龄野生型小鼠,差异有统计学意义（t=3.232,P=0.018;t=5.797,P=0.001）.Aβ在野生型小鼠视网膜内几乎无沉积,而在AD模型小鼠视网膜内12月龄较3月龄表达明显增强,差异有统计学意义（t=6.486,P=0.001）.与3月龄野生型小鼠相比,同龄AD模型小鼠视网膜内的星形胶质细胞数量明显增加[（602.60±36.35）个/mm^2 vs （309.52±41.55）个/mm2],差异有统计学意义（t=5.309,P=0.006）,且突起增多、变短.结论 Aβ的沉积与AD模型小鼠视网膜的神经退行性变密切相关.