牛布氏杆菌病和分枝杆菌病二联表位疫苗的构建及其免疫效果评价

为研发一种更安全、有效的防控牛布氏杆菌病和分枝杆菌病的疫苗,运用在线软件ABCPerd和IEBD对牛布氏杆菌外膜蛋白(Omp25)和牛分枝杆菌抗原85A(Ag85A)的B、T细胞表位进行预测分析,设计新的表位基因肽段NewⅠ和NewⅡ,并通过SOPMA和VaxiJen在线软件对NewⅠ和NewⅡ的二级结构与抗原性进行分析。将NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A基因序列依次用自剪切肽T2A、P2A、E2A进行连接,获得串联基因并命名为COE,将COE基因构建至真核表达载体GV658,获得重组质粒GV658-COE;将上述重组质粒转染至HEK293细胞,利用细胞计数(CCK-8)试验评估GV658-COE对细胞的安全性,通过免疫印迹分析目的蛋白的表达情况;将重组质粒以400μg/只的剂量免疫大鼠,检测在第3次免疫后的血清抗体及大鼠脾淋巴细胞中的T细胞亚群占比情况。结果显示:NewⅠ和NewⅡ序列二级结构较稳定,抗原性良好;重组质粒经PCR扩增获得3231 bp大小的目的条带,与预计相符;重组质粒对HEK293细胞无毒性作用;重组质粒在HEK393细胞中可表达出目的蛋白,分别在22.3、17.3、23.9和35.6 kDa处有目的蛋白NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A的表达。三免后,重组质粒免疫大鼠产生的IgG水平均高于空载质粒组和PBS组;与PBS组相比,重组质粒免疫大鼠脾脏中CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞百分比均升高。研究表明,重组质粒GV658-COE能有效激发大鼠的体液免疫和细胞免疫反应,可成为预防牛布氏杆菌病和分枝杆菌病的候选疫苗。

弓形虫ROPs DNA疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护作用

为了评价弓形虫棒状体蛋白(ROPs)DNA疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护作用,试验将获取的ROP5、ROP17和ROP18基因分别与pVAX1载体连接,获得重组质粒pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP17和pVAX1-ROP18。将重组质粒转染至HEK293A细胞中,利用Western-blot方法检测目的蛋白在真核细胞内的表达情况。将获得的重组质粒等摩尔比混合后通过腿部肌肉注射免疫小鼠作为混合疫苗组,同时设置空载体组及生理盐水组,免疫后检测小鼠血清IgG抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况、细胞因子水平及T淋巴细胞分型,加强免疫后第14天对小鼠腹腔接种弓形虫RH株并观察其生存情况。结果表明:重组质粒经PCR扩增、测序及双酶切验证,分别在1686,1863,1701 bp处出现特异性条带,与目的基因大小一致且无碱基增加、缺失和突变情况;重组质粒经Western-blot检测在62,68,63 ku处成功表达;与空载体组、生理盐水组相比,混合疫苗组血清IgG抗体水平、脾淋巴细胞增殖指数、IFN-γ和IL-6细胞因子、CD4^(+)T淋巴细胞占比和CD4^(+)/CD8^(+)均极显著升高(P<0.01),免疫小鼠攻虫后的生存时间[(18.4±1.4)d]极显著延长(P<0.01)。说明构建的弓形虫ROPs DNA疫苗pVAX1-ROP5/ROP17/ROP18能够刺激小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,并能增强小鼠抵抗弓形虫感染的能力。

鸡源大肠杆菌的分离鉴定及其致病性分析

天津某规模化鸡场出现一批疑似大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)感染的病鸡,为分离该鸡病的病原菌并分析其致病性,研究通过临床综合诊断、病料采集、细菌分离培养、鉴别培养基和生化鉴定、16S rRNA检测、系统进化树与同源性分析、药敏试验、毒力基因检测、小鼠致病性试验及病理组织学观察等综合分析。结果显示,临床剖检可见典型的腹膜炎、肝周炎、心包炎等症状;分离菌株革兰氏染色为阴性短小杆状菌,培养基和生化鉴定结果与大肠杆菌的生长特性一致;16S rRNA特异性引物PCR扩增和系统进化树及同源性分析发现,分离菌株与大肠杆菌亲缘关系为同一分支,同源性高达99.99%以上;药敏试验显示该分离菌株对氟苯尼考高度敏感,对四环素、多西环素中度敏感;PCR扩增出fimC、hlyF、ompT和iroN 4种大肠杆菌毒力基因;动物致病性试验中接种分离菌株的小鼠在16 h内全部死亡,且在小鼠肝脏和血液中均检测到细菌;病理组织学观察发现感染小鼠的肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾脏以及肠道均受到不同程度损伤。研究结果表明,该病鸡分离菌株为大肠杆菌,且该菌株具有多重耐药性并携带多种毒力基因,对动物有较强的致病力。研究结果为鸡场防控大肠杆菌病及科学用药提供参考依据。

弓形虫鸡尾酒DNA疫苗的免疫保护作用研究

研究旨在构建弓形虫鸡尾酒DNA疫苗并评价其对小鼠的免疫保护效果。研究将编码弓形虫棒状体蛋白ROP5、ROP9和ROP17的基因分别构建至真核表达载体pVAX1上,获得重组真核表达质粒pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP9和pVAX1-ROP17,将上述质粒进行PCR和双酶切验证,并通过Western blot检测重组质粒在真核细胞中表达。将三种重组质粒按1∶1∶1的比例混合后,取100μg通过腿部肌肉注射免疫小鼠,加强免疫后,检测小鼠血清抗体、脾淋巴细胞增殖及细胞因子水平,并接种弓形虫RH强毒株进行攻毒,评价免疫后小鼠的保护效果。真核表达质粒pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP9和pVAX1-ROP17经PCR和双酶切验证的结果显示:分别在1686bp、1128bp和1836 bp处出现特异性目的条带;Westernblot检测结果发现,在约为62、41和68kDa处出现目的条带,分别与预期目的蛋白ROP5、ROP9和ROP17的分子量大小相符。与空载体组和生理盐水组小鼠相比,疫苗免疫组小鼠产生的血清中抗体IgG和淋巴细胞产生的细胞因子IFN-γ和IL-6水平、脾脏淋巴细胞增殖的刺激指数(SI)均极显著升高(P<0.01),且接种弓形虫RH强毒株后,免疫组小鼠的存活时间(16.1±2.07)比对照组小鼠存活时间(9.2±0.74或9.0±0.77)极显著延长(P<0.01)。研究结果表明,成功构建的弓形虫鸡尾酒DNA疫苗pAX1-ROP5/ROP9/ROP17能激发小鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应,并增强小鼠对弓形虫感染的抵抗能力。研究结果为弓形虫新型疫苗研制提供借鉴和参考。

犬源肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

为了对采集自天津市某动物医院犬子宫蓄脓脓汁进行病原菌的鉴定,试验采用分离培养方法进行病原菌的分离,同时对分离到的菌株进行生化试验、药敏试验、16S rRNA测序鉴定,对测序结果进行同源性分析并构建系统遗传进化树。结果表明:共分离得到两株(Fl-rj、Fs-rj)革兰氏阴性短杆菌,两株分离菌的生化特性基本一致,且都与肺炎克雷伯氏菌的生化特性相似。两株分离菌16S rRNA基因测序结果相似度高达99.8%,且两株分离菌与肺炎克雷伯氏菌(NR117683.1)的同源性分别高达99.6%和99.9%,在系统进化树中位于同一分枝。两株分离菌均对氨曲南、头孢唑林、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢他啶、妥布霉素敏感,对氨苄西林、头孢噻吩、麦迪霉素、哌拉西林耐药。说明本试验分离菌株目前耐药性不强,可使用头孢类药物抑制。

不同溶血性大肠杆菌的分离与鉴定

为明确伴侣动物化脓性疾病的致病原因,对某动物医院门诊两只母犬的子宫脓性分泌物进行病原微生物学鉴定。通过观察病料接种培养基菌落形态、革兰氏染色镜检、生化试验、药敏试验以及16S rRNA基因序列比对分析,分离菌分别为α溶血和β溶血性大肠埃希氏菌。β溶血性大肠杆菌对卡那霉素、链霉素、头孢噻吩等耐药,α溶血性大肠杆菌仅对麦迪霉素耐药,β溶血菌株耐药性明显高于α溶血菌株,为防治溶血性大肠杆菌引起的相关感染提供参考依据。

减毒沙门菌介导牛结核杆菌多表位疫苗的构建及免疫反应性研究

目的构建以减毒沙门菌为载体的牛结核杆菌多表位疫苗,免疫小鼠后观察其刺激产生的免疫反应。方法运用BepiPred和IEBD对牛结核杆菌Ag85B、MPT63和HSP65的B、T细胞表位进行预测分析,设计新的表位基因肽段AMH,通过ProtParam、VaxiJen、ProtScale、TMHMM、SOPMA和SWISS-MODEL在线软件对AMH的理化性质、免疫原性、亲水性、跨膜区和空间结构进行分析,利用C-IMMSIM进行免疫模拟。将AMH、Ag85B、MPT63和HSP65基因序列用T2A和P2A连接后构建入真核表达载体pEGFP-N1。将重组质粒导入减毒沙门菌LH430,对重组减毒沙门菌进行PCR检测。取重组减毒沙门菌以每只2×10^(7)cfu/200μL的剂量灌胃免疫小鼠2次,检测末次免疫后小鼠血清抗体和细胞因子水平及脾淋巴细胞中的T细胞亚群百分率。结果共筛选出17条表位肽段,构建的表位蛋白序列AMH分子质量为30.21339 ku。生物信息学预测AMH结构稳定,亲水性高,无跨膜区,二级结构松散易与抗体结合。免疫模拟显示AMH可引起B细胞和TH细胞免疫反应,刺激抗体IgM、IgG和细胞因子IFN-γ、IL-2水平升高。重组质粒经双酶切得到4713 bp和3133 bp两条目的片段,PCR扩增的目的基因片段大小与预期相符,且重组减毒沙门菌经PCR扩增获得3133 bp的片段。与PBS组和空载减毒沙门菌组相比,小鼠经重组减毒沙门菌加强免疫后血清IgG水平显著升高(均P<0.01),细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10水平显著升高(均P<0.05),脾脏CD4^(+)T淋巴细胞占比和CD4^(+)/CD8^(+)值均显著升高(均P<0.05)。结论重组减毒沙门菌能激发小鼠的体液免疫和细胞免疫反应,为牛结核病新型疫苗的研制奠定了基础。