Atp5a1基因在新疆哈萨克族食管癌中的表达分析

目的利用比较蛋白质组学方法获得差异表达蛋白,从中寻找与新疆哈萨克族食管癌发生、发展密切相关的基因,为新疆哈萨克族食管癌的早期诊断和治疗提供依据。方法利用二维凝胶电泳(2-dimensionelectrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术联用检测新疆哈萨克族食管癌癌组织与远端正常组织的差异表达蛋白,对其中表达上调的Atp5a1基因进行RT-PCR验证。结果 2-DE结果显示新疆哈萨克族食管癌癌组织中Atp5a1明显可见,蛋白表达强度差异>1.5倍。RT-PCR验证结果显示,癌组织中Atp5a1mRNA明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Atp5a1基因的高表达和食管癌的发生、发展密切相关。

Eca109细胞中自噬模型的建立

目的:在食管鳞癌细胞Eca109中建立自噬模型.方法:按照常规细胞培养方法,将pmcherry-GFP-LC3质粒转染进入Eca109细胞,mcherry为红色荧光蛋白,GFP为绿色荧光蛋白,可示踪自噬体形成.加入浓度为50nmol/L自噬激活剂雷帕霉素,建立自噬模型.采用电镜观察雷帕霉素诱导后细胞中自噬小体的产生,激光共聚焦显微镜观察自噬发展的阶段,并对发生自噬行为的细胞进行计数.结果:雷帕霉素诱导后可见明显的自噬小体,激光共聚焦采图可见自噬细胞数量明显增多(P<0.05).结论:1.在Eca109细胞中通过加入自噬诱导剂雷帕霉素成功构建细胞自噬模型;2.细胞自噬模型的建立为研究肿瘤细胞自噬活动的现象和分子调控机制提供了新的实验平台.

miRNA慢病毒表达载体的构建及其在原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中的稳定表达

目的:构建miRNA的慢病毒表达载体,使其在原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中稳定表达。方法:将该干扰片段构建入慢病毒载体(pL KD-Ubc-eG FP-U6-shRNA)的U6启动子下游,该载体可以实现在干扰小片段RNA的同时表达绿色荧光蛋白EGFP基因,便于观察载体工作状态。通过脂质体转染法转染原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞,观察转染的原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞的形态及表达情况。结果:针对筛选的miRNA构建的慢病毒载体,经过DNA测序结果和琼脂糖凝胶电泳鉴定成功构建了筛选的miRNA的慢病毒表达载体,重组质粒转染原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞,经24 h后在荧光倒置显微镜下可以观察到部分细胞带有绿色荧光,筛选的miRNA构建的慢病毒载体在原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中稳定表达。结论:筛选的miRNA的慢病毒表达载体构建成功,并稳定的转染到原代培养的大鼠胚胎大脑皮层神经细胞中,为miRNA对神经细胞存活功能的研究提供了平台。

ARRB2基因在新疆哈萨克族患者食管癌中的表达及其与临床病理特征的关系

目的探讨新疆哈萨克族患者食管鳞状细胞癌中基因ARRB2 mRNA的表达情况及其与临床病理特征之间的关系。方法采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测ARRB2基因在40例哈萨克族食管癌患者组织及其对应的远端无癌组织中的表达。结果 ARRB2基因在癌组织和远端无癌组织中的表达阳性率分别为62.5%,60.0%,差异无统计学意义(P>0.05)。ARRB2的表达与组织分化、TNM分期有关(P<0.05)。T内参/N内参≤0.5阳性表达差异率为42.5%(17例),T内参/N内参≥2阳性表达差异率为25.0%(10例)。结论新疆哈萨克族食管癌患者肿瘤组织ARRB2阳性表达率与组织分化、TNM分期有关。

Flag-p107真核表达载体的构建及其在ECA109细胞表达及鉴定

目的构建N端含flag标签的p107的真核表达载体,及其在EC109细胞表达的鉴定。方法设计引物在p107蛋白N端增加flag标签,通过PCR扩增获得3×flag-p107cDNA片段,将此片段插入真核表达质粒CMV-MCS-SV40-Neomycin中;再与质粒CMV-MCS-SV40-Neomycin连接,将所得的融合基因进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用电转染将其转染至ECA109细胞中;利用Western-Blotting检测融合蛋白CMV-MCS-3flag-p107-SV40-Neomycin的表达情况。结果重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在ECA109细胞中表达。结论成功构建真核表达载体CMV-MCS-3flag-p107-SV40-Neomycin并建立了其在ECA109细胞的表达。

HPV16 E6/E7对凋亡调控基因表达影响的研究

目的探讨HPV16E6/E7对KYSE450细胞中凋亡调控因子Bcl-2和Bad表达的影响。方法采用瞬时转染技术将HPV1E6/E7融合基因的真核表达载体转染食管癌细胞株KYSE450中,分组用TSA(HDACi)处理后,收集RNA,应用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR)技术检测Bcl-2、Bad的mRNA表达情况。结果 (1)用RT-PCR检测转染后的结果为阳性。(2)Bad mRNA在食管癌细胞KYSE450中表达较低,E6E7过表达对细胞内Bad基因mRNA水平无影响,各转染组之间没有差异。(3)Bcl-2mRNA在食管癌细胞KYSE450中均有表达,E6/E7对Bcl-2有轻度调控作用。(4)HDAC抑制剂TSA处理后,TSA明显增加了E6对Bcl-2基因表达的诱导调控作用。结论 KYSE450细胞中E6和E7基因促进Bcl-2在转录水平上的表达,而对Bad的表达无明显的影响。在病毒感染鳞状上皮细胞后早期表达致癌基因E6、E7可能诱导凋亡调控因子Bcl-2在转录水平上的表达。

Bad真核表达载体的构建及鉴定

目的构建促凋亡基因Bad真核表达载体并鉴定其在人食管鳞癌细胞ECA109和KYSE450细胞中的表达。方法设计Bad基因引物,通过PCR扩增获得其cDNA片段,经双酶切后,将此片段克隆至真核表达载体GV142中,转入DH5α,获得重组质粒GV142-Bad;PCR扩增、酶切及测序验证后,将其及对照空载体转染人食管鳞癌ECA109和KYSE450细胞,转染后24h,通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光信号的表达情况,提取总RNA,使用qPCR检测Bad在转录水平的表达。结果成功构建Bad真核表达载体,PCR扩增出长为545bp的特异性片段,经克隆至真核表达载体GV142后酶切及测序鉴定准确。重组质粒GV142-Bad成功转染食管鳞癌细胞并在荧光倒置显微镜下观察到不同强度的绿色荧光信号。应用qPCR检测重组质粒GV142-Bad转染ECA109和KYSE450细胞的Bad基因mRNA表达水平上调,与空载体转染组和空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究成功构建Bad真核表达载体,用电转染法成功转染食管鳞癌ECA109和KYSE-450细胞,获得高表达并上调Bad基因mRNA的水平,为进一步研究Bad基因的功能奠定了基础。