新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备

目的:PCR扩增得到新基因ZNFD(Znf domain containing protein),构建pET32a-ZNFD原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:通过PCR的方法克隆新基因ZNFD,选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列,克隆到原核表达载体pET32a上,利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论:得到纯化的ZNFD蛋白,制备的多克隆抗体达到了一定的效价,且具有高特异性,为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。

大鼠新基因PMP22CD的克隆以及多克隆抗体的制备

目的:通过PCR克隆PMP22CD基因,构建原核表达载体PET-32a(+)/PMP22CD,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定基础。方法:通过PCR的方法克隆PMP22CD基因,选择抗原性较强的C-端,构建原核表达载体PET32a(+)/PMP22CD,在大肠杆菌BL21(DE3 Lysis)中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白以包涵体的形式存在,应用电洗脱的方式获得重组蛋白,免疫新西兰大白兔,获得抗血清,通过琼脂糖双扩和Western Blot检测抗血清效价和特异性。结果:经测序鉴定成功克隆PMP22CD基因,并构建PET-32a(+)/PMP22CD重组质粒,表达融合蛋白,免疫新西兰大白兔,获得PMP22CD多克隆抗体。结论:得到了纯化的PET-32a(+)/PMP22CD融合蛋白,获得了效价高、特异性强的抗体。

反义caveolin-1对实质肿瘤细胞中β3-半乳糖基转移酶7表达的调节作用

目的:研究反义caveolin-1对实质肿瘤细胞中β3-半乳糖基转移酶7(β3GalT7)表达的调节,以期阐明caveolin-1与β3GalT7的相关性。方法:运用脂质体介导转染人工合成的caveolin-1反义核苷酸(ASODN)至人类4种实质肿瘤细胞中,通过荧光显微镜、RT-PCR及蛋白质印迹检测β3GalT7表达的变化。结果:转染反义caveolin-1后的4种实质肿瘤细胞中β3GalT7均有明显的增强。结论:表明caveolin-1调节肿瘤细胞中β3GalT7的表达,且与β3GalT7的表达呈负相关。