OX40-OX40L信号通过活化T细胞核因子c1调控ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样斑块形成

目的:探讨OX40-OX40L信号是否通过活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)调控动脉粥样硬化斑块的形成。方法:选取18只载脂蛋白基因敲除(Apo E^(-/-))小鼠,随机均分为3组(n=6):对照组(慢病毒对照预处理后腹腔注射Ig G2b 200μg)、OX40激动组(慢病毒对照预处理后腹腔注射激动型OX40抗体200μg)、沉默NFATc1组(si NFATc1慢病毒处理后腹腔注射激动型OX40抗体200μg),采用颈动脉硅胶圈快速置入法构建动脉粥样硬化斑块模型;HE及Masson染色检测动脉血管内膜病理改变;免疫组织化学和蛋白质印迹法检测动脉粥样硬化斑块内NFATc1表达。结果:HE及Masson染色结果显示,与对照组相比,OX40激动组小鼠颈动脉斑块面积增加,内膜增生明显,斑块内胶原纤维增生明显;沉默NFATc1组颈动脉斑块面积明显减少,内膜增生程度明显降低,斑块内胶原纤维增生减弱。免疫组织化学结果显示,与对照组比较,OX40激动组颈动脉斑块中NFATc1表达明显增加(t=9.896,P<0.01),而沉默NFATc1组表达明显减少(t=-3.167,P<0.05)。蛋白质印迹结果显示,OX40激动组颈动脉斑块中NFATc1表达较对照组明显增高(t=17.648,P<0.01),沉默NFATc1组颈动脉斑块中NFATc1蛋白表达量较OX40激动组表达明显减少(t=-4.747,P<0.05)。结论:OX40-OX40L信号通过NFATc1调控动脉粥样硬化斑块的形成。

OX40-OX40L相互作用对NFATc1表达及斑块形成的影响

目的探讨OX40-OX40L相互作用对活化T细胞核因子c1(NFATc1)及动脉粥样硬化斑块形成的影响。方法选取33只载脂蛋白(Apo)E-/-小鼠,分为对照组、OX40刺激组、OX40刺激+沉默NFATc1组,采用颈动脉硅胶圈置入法建立斑块模型;Masson染色检测斑块组成;采用免疫组化检测斑块内NFATc1和CD68分布。细胞实验以小鼠脑微静脉内皮细胞为对象,分为对照组、OX40刺激组和OX40抑制组。斑块及细胞表达NFATc1采用qRT-PCR和Western blot方法检测。结果细胞实验显示,OX40刺激组小鼠内皮细胞NFATc1蛋白及mRNA表达明显高于对照组(P<0.05),而OX40抑制组小鼠内皮细胞NFATc1蛋白及mRNA表达低于OX40刺激组(P<0.05)。动物实验显示,OX40刺激组Apo E-/-小鼠斑块中NFATc1蛋白及mRNA表达高于对照组(P<0.05),而OX40刺激+沉默NFATc1组Apo E-/-小鼠斑块中NFATc1蛋白及mRNA表达低于OX40刺激组(P<0.05)。OX40刺激组斑块面积与对照组相比显著增加,斑块内纤维增生明显,而OX40刺激+沉默NFATc1组较刺激组斑块面积明显减少,纤维增生程度减弱。OX40刺激组Apo E-/-小鼠斑块内NFATc1及CD68表达高于对照组,而OX40刺激+NFATc1沉默组小鼠斑块内NFATc1及CD68表达低于OX40刺激组。结论 OX40-OX40L信号调控NFATc1表达并影响动脉粥样硬化斑块的形成。

2型糖尿病患者中性粒细胞趋化功能受损及可能机制

目的:探讨2型糖尿病患者中性粒细胞趋化功能是否受损及其潜在机制。方法:按WHO诊断标准,招募确诊的2型糖尿病患者及健康同龄志愿者各45例,受检测的中性粒细胞均取自受试者肘静脉外周血。使用改良的琼脂糖下趋化模型检测两组患者中性粒细胞趋化功能,流式细胞术及免疫荧光法检测中性粒细胞膜表面P2X1受体表达水平。在干预实验中,分别使用稀释的2型糖尿病患者或健康对照的血浆(90%、20%),不同葡萄糖含量(5、12和25 mmol/L)的培养基,糖基化终产物(0.5、1、2和4 mmol/L)以及棕榈酸(50、100和200μmol/L)刺激健康对照中性粒细胞后检测趋化功能。结果:与健康对照组相比,2型糖尿病患者中性粒细胞趋化功能显著降低(P<0.001),膜表面P2X1受体表达明显增加(P<0.001),二者呈负相关(r=-0.60,P<0.001)。相较于对照组,高浓度2型糖尿病患者血浆显著抑制中性粒细胞趋化功能(P<0.001);不同浓度的糖基化终产物及葡萄糖对中性粒细胞趋化功能没有明显抑制(P>0.05);高浓度棕榈酸(200μmol/L)明显抑制中性粒细胞趋化功能(P<0.05),同时促进细胞膜表面P2X1受体表达(P<0.05),二者呈负相关(r=-0.67,P<0.05)。结论:2型糖尿病患者中性粒细胞趋化功能受损,高浓度棕榈酸通过P2X1受体抑制中性粒细胞趋化功能。

中性粒细胞与烧伤脓毒症

脓毒症是严重烧伤最常见的并发症,也是危害危重烧伤患者生命的首要因素。烧伤脓毒症患者的病死率高达75%。中性粒细胞是先天性免疫细胞之一,也是感染部位募集最早、最多的免疫细胞,在局部感染的清除和损伤组织修复方面发挥关键作用。众多研究已深入揭示了烧伤脓毒症的发病和进展机制,中性粒细胞在其中的作用逐渐明朗。该文详细阐述了中性粒细胞在烧伤脓毒症发生、发展中的关键机制,并基于中性粒细胞在烧伤脓毒症中的独特生物学行为,探讨了其在烧伤脓毒症预警与预后判断方面的价值以及烧伤脓毒症的潜在治疗手段。

红色诺卡菌细胞壁骨架对人中性粒细胞生物学功能的调节作用

目的探讨红色诺卡菌细胞壁骨架(Nr-CWS)对人中性粒细胞生物学功能的调节作用及其机制。方法采用实验研究方法。2022年5―10月招募于苏州市体检中心体检的成年健康志愿者15名(男7名、女8名,年龄24~45岁),采集外周静脉血,采用免疫磁珠分选法提取中性粒细胞。将细胞分为不进行任何处理的正常对照组、仅用终质量浓度为60 ng/mL Nr-CWS处理的单纯Nr-CWS组、仅用终质量浓度1μg/mL内毒素/脂多糖(LPS)刺激的单纯LPS组、用同前LPS刺激后再用Nr-CWS处理的LPS+Nr-CWS组。培养1 h,采用改良后的琼脂糖趋化模型检测中性粒细胞的趋化距离、趋化细胞百分比、趋化指数、最大趋化速度、趋化功能评分;采用流式细胞术检测发生吞噬的细胞占比与荧光强度,活性氧水平,颗粒蛋白CD35、CD66b、CD63的蛋白表达水平,以及细胞培养上清液中炎症因子白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素浓度。以上实验各组样本数均为15。对数据行析因设计方差分析与独立样本t检验。结果培养1 h,正常对照组、单纯Nr-CWS组、单纯LPS组、LPS+Nr-CWS组细胞趋化功能评分分别为15.0、(14.5±0.5)、(1.5±0.5)、(12.0±1.5)分;与正常对照组比较,单纯LPS组与LPS+Nr-CWS组细胞趋化距离、趋化细胞百分比、趋化指数、最大趋化速度与趋化功能评分均显著降低(t值分别为18.36、18.88、54.28、18.36、46.77,10.58、14.74、6.84、10.58、4.24,P<0.05);与单纯LPS组比较,LPS+Nr-CWS组细胞上述5项趋化功能指标均显著升高(t值分别为11.47、14.65、11.62、11.47、13.75,P<0.05)。培养1 h,与正常对照组比较,单纯Nr-CWS组发生吞噬的细胞占比与荧光强度均显著升高(t值分别为6.86、6.73,P<0.05),单纯LPS组(t值分别为7.35、22.72,P<0.05)与LPS+Nr-CWS组(t值分别为21.37、13.10,P<0.05)发生吞噬的细胞占比与荧光强度均明显降低。培养1 h,与正常对照组比较,单纯LPS组细胞活性氧水平显著升高(t=6.64,P<0.05);与单纯LPS组比较,LPS+Nr-CWS组细胞活性氧水平明显降低(t=5.46,P<0.05)。培养1 h,与正常对照组比较,单纯LPS组与LPS+Nr-CWS组细胞CD35、CD66b、CD63蛋白表达均显著升高(t值分别为16.75、17.45、10.82,5.70、19.35、15.37,P<0.05);与单纯LPS组比较,LPS+Nr-CWS组细胞CD35、CD66b、CD63蛋白表达均明显下降(t值分别为4.92、5.72、3.18,P<0.05)。培养1 h,与正常对照组比较,单纯LPS组细胞培养上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、γ干扰素浓度均显著升高(t值分别为22.10、9.50、7.21、10.22、24.88、8.43、47.48,P<0.05),LPS+Nr-CWS组细胞培养上清液中IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、γ干扰素浓度均显著上升(t值分别为4.68、5.12、8.02、5.58、7.13,P<0.05);与单纯LPS组比较,LPS+Nr-CWS组细胞培养上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、γ干扰素浓度均显著降低(t值分别为5.39、2.83、5.79、2.90、5.87、4.88、39.64,P<0.05)。结论Nr-CWS能够提高正常状态下人中性粒细胞的吞噬能力,改善感染状态下人中性粒细胞的趋化功能及活性氧、脱颗粒蛋白、炎症因子水平,在先天免疫层面通过调控人中性粒细胞生物学行为,提高抗感染能力。

严重烧伤患者外周血中性粒细胞凋亡延迟的机制研究

目的 观察严重烧伤患者外周血中性粒细胞凋亡率改变,探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂对其凋亡的影响.方法 选择2019年1月至5月南京医科大学附属苏州医院烧伤整形科收治的严重烧伤患者〔烧伤面积≥30%总体表面积(TBSA),深Ⅱ~Ⅲ度,烧伤指数≥20%,年龄>20岁〕,以及同期健康体检志愿者.取研究对象外周静脉血,用Ficoll梯度离心法分离得到中性粒细胞,将严重烧伤患者中性粒细胞分为烧伤组和p38MAPK抑制剂SB203580组(加入SB203580常温孵育30 min后于培养箱培养24 h);健康志愿者中性粒细胞作为对照组.采用流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡率;用荧光探针法检测细胞活性氧(ROS)生成水平;用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞p38MAPK蛋白表达及其磷酸化(p-p38MAPK)水平.结果 与对照组比较,烧伤组中性粒细胞凋亡率明显降低〔(37.42±3.14)%比(50.20±9.87)%,P<0.05〕,中性粒细胞中ROS生成水平明显增加(荧光强度:83.28±0.29比75.23±0.34,P<0.05).SB203580组中性粒细胞凋亡率较烧伤组进一步降低〔(25.51±1.56)%比(37.42±3.14)%,P<0.05〕,ROS生成水平进一步升高(荧光强度:95.56±3.67比83.28±0.29,P<0.05).3组细胞p38MAPK蛋白表达水平差异无统计学意义;而烧伤组细胞p-p38MAPK蛋白表达水平却较对照组明显降低(p-p38MAPK/p38MAPK :0.45±0.06比0.91±0.09, P<0.05),加入p38MAPK抑制剂SB203580使得细胞内p-p38MAPK蛋白表达水平较烧伤组进一步降低(p-p38MAPK/p38MAPK:0.22±0.04比0.45±0.06,P<0.05).结论 严重烧伤患者外周血中性粒细胞凋亡延迟, ROS生成水平增加,其机制可能与p38MAPK通路抑制相关.

严重烧伤患者早期外周血中性粒细胞趋化功能变化及影响因素

目的观察严重烧伤患者早期外周血中性粒细胞趋化功能变化及影响因素。方法将2019年1—5月南京医科大学附属苏州医院收治的符合入选标准的7例伤后6 h内入院的严重烧伤患者纳入烧伤组[男4例、女3例,年龄(36±10)岁],同期招募该单位体检中心体检结果正常的7名健康志愿者纳入健康对照组[男5名、女2名,年龄为(35±8)岁],进行前瞻性对照研究。(1)烧伤组患者于入院后1、3、5 d各抽取2 mL静脉血,健康对照组志愿者取2 mL静脉血,常规检测白细胞计数、血小板计数、中性粒细胞计数及血清降钙素原、C反应蛋白水平。(2)同前取烧伤患者和健康志愿者静脉血,酶联免疫吸附测定法检测白细胞介素6(IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。(3)同前取烧伤患者和健康志愿者静脉血,Ficoll密度梯度离心法分离外周血中性粒细胞,琼脂糖趋化实验检测细胞趋化距离,流式细胞仪仅检测烧伤组患者入院后3 d及健康对照组志愿者趋化因子受体CXCR1、CXCR2阳性表达率。对数据行重复测量方差分析、t检验及Bonferroni校正。结果(1)烧伤组患者入院后1、3、5 d血小板计数与健康对照组志愿者相近(t=0.55、0.44、0.12,P>0.05)。烧伤组患者入院后1、3、5 d中性粒细胞计数、白细胞计数及血清降钙素原、C反应蛋白表达水平均明显高于健康对照组志愿者(t=196.96、273.31、45.22,3.46、4.18、5.55,4.36、5.26、11.13,64.94、89.97、84.31,P<0.01)。(2)烧伤组患者入院后1、3、5 d IL-6水平明显高于健康对照组志愿者(t=187.43、213.54、195.74,P<0.01),IL-10水平明显高于健康对照组志愿者(t=21.47、11.13、6.23,P<0.01),TNF-α水平明显高于健康对照组志愿者(t=5.27、7.89、15.58,P<0.01)。(3)烧伤组患者入院后1、3、5 d中性粒细胞趋化距离分别为(1479±102)、(1395±82)、(1017±91)μm,明显短于健康对照组志愿者的(1902±120)μm,t=7.11、9.23、15.55,P<0.01。(4)烧伤组患者入院后3 d中性粒细胞CXCR1、CXCR2阳性表达率分别为(48.3±1.6)%、(79.0±1.8)%,明显低于健康对照组志愿者的(95.4±4.5)%、(97.8±2.1)%,t=27.13、23.10,P<0.01。结论严重烧伤患者早期外周血中性粒细胞趋化功能障碍,这可能与CXCR1、CXCR2降低有关。

自噬对脓毒症小鼠中性粒细胞程序性死亡配体-1表达的影响

目的探讨自噬对脓毒症小鼠中性粒细胞程序性死亡配体-1(PD-L1)表达的影响及其作用机制。方法①体内实验:将6~8周龄雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、盲肠结扎穿孔术(CLP)组和雷帕霉素(RAP)+CLP组,每组10只。采用CLP模拟脓毒症模型;Sham组不结扎盲肠及穿孔,其他操作同CLP组。RAP+CLP组小鼠于制模前7 d腹腔注射自噬激动剂RAP 4 mg·kg-1·d-1;Sham组和CLP组不予任何处理。各组于术后4 d留取肺脏、肝脏、脾脏和胰腺组织进行免疫组化染色,光镜下观察各器官中性粒细胞的浸润情况;通过免疫荧光染色检测术后1 d、4 d小鼠肺脏中性粒细胞免疫抑制分子PD-L1和自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达。②体外实验:提取和重悬小鼠骨髓中性粒细胞至1×1010/L,分为空白对照组(不给予任何处理)、RAP对照组(RAP 100μmol/L)、自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf)对照组(Baf 10μmol/L)、脂多糖(LPS)刺激组(LPS 1 mg/L)、RAP+LPS组、Baf+LPS组,后两组分别于LPS刺激前30 min给予100μmol/L RAP或10μmol/L Baf预处理。于LPS刺激0、4、12 h用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测中性粒细胞PD-L1 mRNA表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测PD-L1、LC3和自噬相关蛋白p62的蛋白表达。结果①体内实验:免疫组化显示CLP术后4 d小鼠肺脏、肝脏、脾脏和胰腺组织中均有大量中性粒细胞浸润;免疫荧光显示,随CLP术后时间延长,小鼠肺脏中性粒细胞LC3阳性表达呈降低趋势,而PD-L1的表达大幅度升高;给予RAP预处理可以促进CLP小鼠LC3的表达,同时抑制PD-L1的表达。②体外实验:在mRNA水平上,随LPS刺激时间延长,小鼠中性粒细胞PD-L1 mRNA表达均呈持续升高趋势,12 h达峰值,且明显高于空白对照组(2-ΔΔCT:72.2±10.0比13.0±0.8,P<0.01);给予自噬抑制剂RAP预处理后,PD-L1的mRNA表达较LPS刺激组明显降低(2-ΔΔCT:12 h为47.4±7.3比72.2±10.0,P<0.01);而给予自噬激动剂Baf预处理后,PD-L1的mRNA表达则较LPS刺激组明显升高(2-ΔΔCT:12 h为109.1±7.4比72.2±10.0,P<0.01)。在蛋白水平上,LPS刺激中性粒细胞后4 h,PD-L1、LC3及p62阳性表达较空白对照组显著增加,且PD-L1和p62随时间延长呈持续增加趋势;当使用RAP预处理后,PD-L1和p62阳性表达明显减少,而LC3表达进一步增加,说明自噬水平增加,自噬流通畅;与此相反,当使用Baf预处理后,PD-L1、LC3及p62表达均显著增加,说明自噬体与溶酶体的结合受阻,自噬流不畅。结论脓毒症时中性粒细胞在各个器官的浸润增加,肺脏中性粒细胞PD-L1表达明显增加,而自噬水平有所下降;LPS刺激下的中性粒细胞PD-L1表达可以被自噬激动剂所抑制,被自噬抑制剂所促进;PD-L1对脓毒症具有负向调控作用,可以通过靶向促进自噬来抑制脓毒症时PD-L1的表达,从而改善脓毒症。

基于16S核糖体RNA高通量测序的严重烧伤患者早期肠道菌群变化分析及代谢功能预测的前瞻性研究

目的基于16S核糖体RNA(16S rRNA)高通量测序分析严重烧伤患者早期肠道菌群变化并进行代谢功能预测。方法本前瞻性观察性研究将2018年1月—2019年12月江苏大学附属医院烧伤整形科收治的48例符合入选标准的严重烧伤患者纳入烧伤组,将同时期于江苏大学附属医院体检中心进行健康检查的符合入选标准的40名健康志愿者纳入健康组。收集烧伤组患者入院后1周左右的粪便标本及健康组志愿者体检当天粪便标本,进行16S rRNA V4区基因测序,分析各类菌属的相对丰度;应用Mothur软件进行操作分类单元(OTU)划分,分析优势菌群;通过QIIME1.9.0软件分析粪便菌群OTU数目、Chao1指数、Ace指数、Shannon指数;采用Canoco Software 5.0对粪便菌群相对丰度做主成分分析;采用京都基因和基因组数据库预测粪便菌群代谢功能。对数据行独立样本t检验、Mann-Whitney U检验。结果烧伤组患者粪便中拟杆菌属、肠球菌属、不动杆菌属、巨球型菌属、葡萄球菌属相对丰度明显高于健康组志愿者(Z=-5.20、-2.37、-5.17、-4.41、-6.03,P<0.05或P<0.01),而健康组志愿者粪便中未分类的毛螺杆菌科、普氏菌属、盲杆菌属、未分类的瘤胃球菌科、假丁酸弧菌属、布劳特菌属、未分类的消化链球菌科(Z=-8.03、-3.21、-7.63、-5.88、-8.05、-8.05、-6.77,P<0.01)等19种菌属的相对丰度明显高于烧伤组患者。健康组志愿者粪便菌群多样性优于烧伤组患者,其主要优势菌群为拟杆菌属、未分类的毛螺杆菌科、普氏菌属、未分类的肠杆菌科、布劳特菌属、副拟杆菌属和大肠志贺杆菌属等,而烧伤组患者粪便主要优势菌群为拟杆菌属、普氏菌属、未分类的肠杆菌科和副拟杆菌属。烧伤组患者粪便菌群OTU数目、Ace指数、Chao1指数、Shannon指数分别为(149±47)个、199±45、190±45、2.0±0.9,显著少/低于健康组志愿者的(266±57)个、323±51、318±51、3.8±0.5(t=10.325、11.972、12.224、11.662,P<0.01)。健康组志愿者和烧伤组患者粪便菌群相对丰度在主成分1被清晰地区分为2个群体,主成分1贡献率为32.50%,P<0.01;健康组志愿者粪便菌群在主成分2上较为集中,烧伤组患者粪便菌群在主成分2上散布较大,主成分2贡献率为13.44%,P>0.05。烧伤组患者粪便菌群氨基酸中丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸、精氨酸-脯氨酸、半胱氨酸-蛋氨酸、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸以及碳水化合物中三羧酸循环、果糖和甘露糖、半乳糖、酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢水平显著低于健康组志愿者(Z=-4.75、-4.54、-4.75、-4.62、-3.71、-3.28、-4.19,-3.82、-4.72、-4.35、-4.75、-4.71,P<0.01),硫辛酸代谢和辅酶Q合成水平明显高于健康组志愿者(Z=-6.07、-4.51,P<0.01),花生四烯酸代谢水平与健康组志愿者相近(P>0.05)。结论基于16S rRNA高通量测序得出,严重烧伤患者早期肠道菌群和健康人群存在明显差异,烧伤患者肠道菌群种类减少,多样性降低,营养代谢水平降低。

肝素结合蛋白增加烧伤早期血管通透性的机制研究

目的:探讨肝素结合蛋白(HBP)对烧伤早期血管通透性改变的影响。方法:①临床研究:采集2019年1月1日至8月30日南京医科大学附属苏州医院收治的12例重度烧伤患者入院0.5 h内全血标本,检测白细胞计数(WBC)、中性粒细胞绝对值和比例以及血清HBP水平;以同期8例严重创伤患者作为对照,以明确重度烧伤患者炎性指标及HBP与其他严重创伤患者的差异。留取12例重度烧伤患者入院9 d内血清标本,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测多糖包被代谢产物黏结合蛋白多糖-1(syndecan-1)和透明质酸(HA)水平。采用线性相关法分析HBP与中性粒细胞比例、syndecan-1和HA的相关性。②基础研究:制备6~8周龄SD大鼠30%总体表面积(TBSA)Ⅲ度烧伤模型,低分子肝素(LMWN)干预组(n=5)大鼠于伤后即刻经腹部皮下注射200 U/kg低分子肝素钠(2 h 1次,共4次);烧伤组(n=5)给予等量生理盐水;正常对照组(n=5)不给予任何干预。分别于伤后0、2、4、8 h取大鼠外周静脉血检测血清HBP、syndecan-1和HA水平,取大鼠肺组织于透射电镜下观察肺血管内皮细胞多糖包被损伤情况。结果:①临床研究结果:12例重度烧伤患者与8例严重创伤患者WBC、中性粒细胞绝对值和比例以及HBP水平均升高,两组WBC、中性粒细胞绝对值和比例差异无统计学意义〔WBC(×10^9/L):14.5±6.1比10.8±3.6,中性粒细胞绝对值(×10^9/L):12.0±5.9比9.0±4.0,中性粒细胞比例:0.81±0.10比0.79±0.14,均P>0.05〕;但烧伤患者HBP水平明显高于创伤患者(μg/L:192.92±61.73比51.17±23.05,P<0.01)。12例重度烧伤患者伤后血清syndecan-1和HA水平急剧升高,并呈持续升高趋势,9 d达峰值〔syndecan-1(μg/L):16.02±0.39,HA(μg/L):106.83±4.90〕。相关分析显示,重度烧伤患者入院1 d血清HBP与中性粒细胞比例、syndecan-1和HA均呈显著正相关(r值分别为0.805、0.732、0.900,均P<0.01)。说明烧伤引起中性粒细胞急剧升高后释放大量HBP,同时血管内皮多糖包被受到严重破坏。②基础研究结果:烧伤组大鼠伤后血清HBP、syndecan-1和HA水平均较正常对照组急剧升高,并随时间延长呈持续升高趋势,伤后8 h达峰值;LMWH干预组血清HBP、syndecan-1和HA水平均较烧伤组明显降低,8 h时差异仍有统计学意义〔HBP(μg/L):6.47±0.25比12.48±0.08,syndecan-1(μg/L):19.06±1.48比25.92±3.34,HA(μg/L):35.76±2.10比54.91±2.64,均P<0.01〕。透射电镜下显示大鼠肺血管多糖包被结构:正常对照组结构连续、分布均匀、致密;烧伤组2 h时结构即明显破坏、脱落,8 h时已基本观察不到多糖包被结构;LMWH干预组结构破坏、脱落现象明显减轻,8 h时仍能观察到多糖包被结构。结论:严重烧伤患者早期血管通透性增加,体液大量丢失,与烧伤早期中性粒细胞急剧升高并释放高水平HBP造成内皮细胞多糖包被破坏有关。

严重烧伤患者休克期肝素结合蛋白的变化及其对人脐静脉血管内皮细胞和中性粒细胞的影响

目的探讨严重烧伤患者休克期肝素结合蛋白(HBP)的变化及其在体外对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和中性粒细胞的影响。方法采用前瞻性观察性研究与实验研究方法。将2020年8—11月南京医科大学附属苏州医院烧伤整形科收治的符合入选标准的20例严重烧伤患者纳入严重烧伤组[男12例、女8例,年龄为44.5(31.0,58.0)岁],同期招募该单位体检中心体检结果正常的20名健康志愿者纳入健康对照组[男13例、女7例,年龄为39.5(26.0,53.0)岁]。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测健康对照组志愿者血浆与严重烧伤组患者伤后48 h内血浆中HBP和组织金属蛋白酶抑制物1(TIMP-1)蛋白表达水平,分别对2组血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达的相关性进行Pearson相关分析。取第4代对数生长期HUVEC进行实验,将细胞按随机数字表法(分组方法下同)分为常规培养的正常对照组(处理下同)与进行相应处理的重组HBP(rHBP)处理12 h组、rHBP处理24 h组、rHBP处理48 h组,采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中TIMP-1的mRNA表达;将细胞分为正常对照组与进行相应处理的rHBP处理48 h组,采用蛋白质印迹法检测细胞中TIMP-1蛋白表达;将细胞分为正常对照组与加入相应试剂处理的单纯rHBP组、单纯抑蛋白酶多肽组、rHBP+抑蛋白酶多肽组(rHBP终物质的量浓度为200 nmol/L,抑蛋白酶多肽终质量浓度为20μg/mL),培养48 h,采用ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平。采用免疫磁珠分选法从前述10名健康志愿者外周静脉血中分离中性粒细胞,将细胞分为正常对照组与加入相应试剂处理的单纯重组TIMP-1(rTIMP-1)组、单纯佛波酯组、rTIMP-1+佛波酯组(rTIMP-1终质量浓度为500 ng/mL,佛波酯终物质的量浓度为10 nmol/L),培养1 h,采用免疫荧光法观测细胞中CD63蛋白表达,采用流式细胞术检测细胞中CD63蛋白阳性表达率,采用ELISA法检测细胞培养上清液中HBP和髓过氧化物酶(MPO)蛋白表达水平。正常对照组均于适宜时间点进行前述相关检测,细胞实验中各组样本数均为3。对数据行χ^(2)检验、Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis H检验、Tamhane T2检验。结果严重烧伤组患者血浆中HBP、TIMP-1蛋白表达水平分别为404.9(283.1,653.2)、262.1(240.6,317.4)ng/mL,均明显高于健康对照组志愿者的61.6(45.0,68.9)、81.0(66.3,90.0)ng/mL(Z值分别为-5.41、-5.21,P<0.01)。健康对照组志愿者血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达相关性不强(P>0.05),严重烧伤组患者血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达呈明显正相关(r=0.64,P<0.01)。与正常对照组比较,rHBP处理12 h组、rHBP处理24 h组、rHBP处理48 h组HUVEC中TIMP-1 mRNA表达水平均显著升高(t值分别为-3.58、-2.25、-1.26,P<0.05)。蛋白质印迹法检测显示,与正常对照组比较,rHBP处理48 h组HUVEC中TIMP-1蛋白表达明显增强。培养48 h,与正常对照组比较,单纯rHBP组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平显著升高(t=9.43,P<0.05),单纯抑蛋白酶多肽组、rHBP+抑蛋白酶多肽组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05);与单纯rHBP组比较,rHBP+抑蛋白酶多肽组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平显著下降(t=4.76,P<0.01)。培养1 h,免疫荧光法和流式细胞术检测的各组中性粒细胞CD63蛋白表达结果趋势一致。培养1 h,与正常对照组比较,单纯rTIMP-1组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05),单纯佛波酯组、rTIMP-1+佛波酯组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均明显升高(t值分别为2.41、3.82,5.73、1.05、4.16、1.08,P<0.05或P<0.01);与单纯佛波酯组比较,rTIMP-1+佛波酯组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均明显下降(t值分别为5.26、2.83、1.26,P<0.05或P<0.01)。结论严重烧伤患者休克期血浆中HBP表达水平增加;HBP可在体外诱导HUVEC分泌TIMP-1,TIMP-1可降低人中性粒细胞CD63分子表达。

脓毒症小鼠中性粒细胞通过CD80/CTLA-4途径影响T淋巴细胞功能

目的探讨脓毒症小鼠中性粒细胞对T淋巴细胞(T细胞)功能的影响以及CD80/细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)途径在其中发挥的作用。方法①体内实验:将6~8周龄雄性C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为假手术组(Sham组,n=20)、Sham+CTLA-4抗体处理组(Sham+aCTLA-4组,n=20)、盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症模型组(CLP组,n=30)和CLP+CTLA-4抗体处理组(CLP+aCTLA-4组,n=30)。采用CLP制备小鼠脓毒症模型;Sham组不对盲肠进行结扎和穿孔,余操作同CLP组;CTLA-4抗体处理组分别于术后6 h、24 h腹腔注射CTLA-4抗体50µg。术后48 h,Sham组、Sham+aCTLA-4组随机取6只小鼠,CLP组和CLP+aCTLA-4组随机取14只小鼠检测脾脏T细胞活化指标CD69的表达;并取脾脏、骨髓和外周血,应用流式细胞仪检测中性粒细胞表面CD80的表达;采用免疫荧光法和流式细胞仪检测脾脏T细胞表面CTLA-4的表达。各组其余小鼠用于观察术后96 h生存情况。②体外实验1:提取健康小鼠骨髓中性粒细胞,分别用LPS(1 mg/L)刺激4、8、12 h,每个时间点设置加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)的对照组,检测各时间点CD80的表达。③体外实验2:提取健康小鼠脾脏T细胞,分为PBS对照组、LPS组(LPS终浓度1 mg/L)、中性粒细胞组和中性粒细胞+LPS组,后两组建立中性粒细胞与T细胞共培养模型后再给予相应处理,检测T细胞表面CTLA-4的表达;以上述4组为对照,再分别设置CTLA-4抗体处理组(CTLA-4抗体终浓度50 mg/L),48 h后采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素-2(IL-2)水平。结果①体内实验结果:与Sham组比较,CLP组脾脏、骨髓、外周血中性粒细胞表面CD80表达均上调,T细胞表面CTLA-4表达明显增加〔(9.98±0.84)%比(3.48±0.64)%,P<0.05〕,说明脓毒症时中性粒细胞可能通过CD80/CTLA-4途径影响T细胞功能。与CLP组比较,CTLA-4抗体可明显提高CLP小鼠96 h累积生存率(56.25%比18.75%,P<0.05),增加T细胞表面CD69的表达,说明CTLA-4抗体可能会促进脓毒症时T细胞活化,并提高生存率。②体外实验结果:随LPS刺激时间延长,中性粒细胞表面CD80表达较PBS对照组明显增加,并呈一定时间依赖性〔4 h:(6.35±0.40)%比(3.41±0.40)%,8 h:(8.57±0.64)%比(3.09±0.27)%,12 h:(19.83±1.06)%比(5.16±0.36)%,均P<0.05〕。与PBS对照组比较,单纯LPS刺激对CD4^(+)/CD8^(+)T细胞表面CTLA-4的表达没有明显影响,而与中性粒细胞共培养后CTLA-4的表达明显增加〔CD4^(+):(4.92±0.30)%比(3.33±0.25)%,CD8^(+):(4.26±0.21)%比(2.53±0.66)%,均P<0.05〕,与LPS刺激的中性粒细胞共培养后CTLA-4表达的增加趋势则更加明显〔CD4^(+):(6.34±0.50)%比(3.33±0.25)%,CD8^(+):(6.21±0.41)%比(2.53±0.66)%,均P<0.05〕。在PBS对照组和LPS组中,CTLA-4抗体对T细胞分泌IL-2无明显影响。与PBS对照组比较,与中性粒细胞共培养能抑制T细胞分泌IL-2(ng/L:1938.00±68.45比2547.00±218.00,P<0.05),与LPS刺激后中性粒细胞共培养则抑制作用更明显(ng/L:1073.00±34.39比2547.00±218.00,P<0.05);而CTLA-4抗体的加入可部分恢复IL-2的分泌。说明中性粒细胞在促进T细胞表面CTLA-4表达后,可能通过减少IL-2生成来介导T细胞功能抑制。结论脓毒症时中性粒细胞可介导T细胞功能障碍,而CD80/CTLA-4途径在其中发挥了重要作用。拮抗CTLA-4后,脓毒症小鼠生存率和T细胞功能明显改善,这可能会成为脓毒症免疫治疗的新方法。