术前丙氨酸氨基转移酶水平对合并肝硬化的肝癌患者R0切除术预后的影响

目的研究分析术前血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平对合并肝硬化的肝细胞癌(LC-HCC)患者R0切除术预后的影响。方法回顾性分析2000年1月至2012年12月于我院获R0切除术的724例合并肝硬化的肝癌患者临床和随访资料。根据术前血清ALT水平,将患者分为增高组(ALT>50 U/L)和对照组(ALT≤50 U/L),并对比分析两组肝癌术后的结局。结果与对照组相比,增高组男性比例、年龄≤60岁比例、血小板<100×109/L比例、乙肝表面抗原(HBs Ag)阳性比例、侵及肝被膜比例、随访期间复发率和病死率较多。单因素分析显示,增高组的1、2、5、10年总体生存率和无瘤生存率明显比对照组要低(P<0.05)。Cox多因素分析显示,术前血小板<100×109/L、肿瘤多发、肿瘤直径>5 cm、血管癌栓及术前血清ALT>50 U/L是影响患者生存的独立危险因素;手术切缘<0.5 cm、肿瘤多发、肿瘤直径>5 cm、血管癌栓及术前血清ALT>50 U/L是影响患者复发的独立危险因素。结论术前血清ALT水平增高是预示合并肝硬化的肝癌患者R0切除术后预后的重要因素之一,其临床价值应被充分重视。

乙型肝炎病毒X蛋白通过调控Notch1信号通路诱导足细胞免疫紊乱

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在肾小球足细胞免疫紊乱中的作用及其调控机制。方法选取14只6周龄雄性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)转基因(HBV transgenic,HBV-Tg)小鼠,以相同周龄野生型(wild type,WT)小鼠作为对照,饲养至不同周龄,检测小鼠24 h尿蛋白量、血生化、肾脏病理以及电镜下足细胞改变;免疫组化法观察HBV-Tg小鼠肾组织HBx蛋白表达及免疫细胞浸润情况。应用pcDNA3.1/myc-HBx质粒转染人足细胞,免疫荧光法检测HBx、足细胞标志物Nephrin在足细胞中的定位;流式细胞术检测足细胞表面主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complexⅡ,MHC-Ⅱ)、共刺激分子CD40的表达;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞培养上清中多种细胞因子的含量;转录组测序(Transcriptome sequencing,RNA-seq)筛选HBx调控的下游基因,实时定量PCR法验证其表达。利用过表达质粒或短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)过表达或沉默Notch1基因后,观察其对足细胞表面免疫分子表达及细胞因子分泌的影响。使用Notch受体抑制剂N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基)]-(s)-苯基甘氨酸叔丁酯{N-[N-(3,5-difluorophenyl-L-alanyl)]-(s)-phenylglycine tert-butyl ester,DAPT}阻断HBV-Tg小鼠体内Notch1信号通路后,观察小鼠血生化、肾脏病理改变以及肾组织免疫细胞浸润情况。结果与WT组小鼠相比,HBV-Tg组小鼠尿蛋白量显著增多(P<0.05),血肌酐、尿素氮水平显著升高(均P<0.05),肾脏病理损伤加重,肾组织HBx蛋白异常表达以及免疫细胞浸润明显。HBx转染人足细胞后其表面免疫分子MHC-Ⅱ、CD40表达上调(均P<0.05),培养上清中单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β含量增加(均P<0.05),IL-4/干扰素γ(interferonγ,IFN-γ)分泌失衡。RNA-seq筛选出HBx下游基因,如Notch1、PLA2R、TLR4等,进一步证实HBx可促进Notch1 mRNA和蛋白表达上调(均P<0.05)。将Notch1基因过表达后,HBx诱导的足细胞表面MHC-Ⅱ、CD40表达显著上调(均P<0.05),其上清中MCP-1、TNF-α及IL-1β的含量明显增加(均P<0.05),IL-4/IFN-γ失衡加重;将Notch1基因沉默后,上述结果则呈相反变化。体内实验结果显示,与HBV-Tg+溶剂组相比,HBV-Tg+Notch受体抑制剂(DAPT)组小鼠血肌酐水平显著下降(P<0.05),肾脏病理损伤及免疫细胞浸润明显改善。结论HBx蛋白可促进足细胞Notch1表达上调;Notch1进一步促进足细胞表面免疫分子表达,并调控细胞因子失衡,从而导致肾小球损伤和免疫微环境紊乱。

KDM6B在乙型肝炎病毒X基因介导的足细胞-巨噬细胞转分化中的作用

目的分析赖氨酸特异性去甲基化酶6B(KDM6B)在乙型肝炎相关性肾炎(HBV-GN)患者肾组织及乙型肝炎病毒X基因(HBx)转染的人足细胞中的表达,及其在HBx介导的足细胞-巨噬细胞转分化(PMT)中的作用。方法选取2013至2018年在上海交通大学附属第一人民医院经肾穿刺活检病理诊断为HBV-GN的48例患者肾活检标本,以30例原发性肾小球肾炎(PGN)肾活检标本及15例肾肿瘤患者癌旁正常肾组织作为对照。利用免疫荧光及免疫组化法观察HBV-GN患者肾组织KDM6B及巨噬细胞标志物F4/80的表达。分析肾组织KDM6B表达水平与HBV-GN患者临床特征的关系。Western印迹法检测足细胞中KDM6B、F4/80、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHC-Ⅱ)以及共刺激分子CD40的表达;ELISA法测定细胞上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-6的含量;同时利用KDM6B小干扰RNA(siRNA)沉默HBx质粒转染的人足细胞中KDM6B基因表达后,Western印迹法检测细胞中KDM6B、F4/80及组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)的表达变化。结果与正常对照组相比,HBV-GN患者肾组织KDM6B表达增加(0.022±0.004比0.006±0.002,P=0.006)。HBV-GN不同病理类型组间KDM6B阳性率差异无统计学意义(P=0.139)。此外,在HBV-GN患者足细胞中可观察到KDM6B和F4/80的共表达。估算肾小球滤过率(eGFR)<60 ml·min^(-1)·(1.73 m^(2))^(-1)或尿蛋白≥3.5 g/d的患者肾组织KDM6B表达分别高于eGFR≥60 ml·min^(-1)·(1.73 m^(2))^(-1)或尿蛋白<3.5 g/d的患者(均P<0.05)。HBx转染人足细胞后KDM6B、F4/80、MHC-Ⅱ以及CD40表达均上调(均P<0.05),上清IFN-γ和IL-6含量均增加(均P<0.05);将KDM6B基因沉默后,HBx所诱导的足细胞F4/80表达下调,H3K27me3表达则上调(均P<0.05)。结论HBx可通过诱导足细胞KDM6B表达启动PMT,可能参与HBV-GN局部组织免疫微环境紊乱的发生。