猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药表型及其SCCmec基因分型研究

目的了解上海猪场及屠宰场耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的流行状况、耐药谱特征及其SCCmec基因分型特点。方法我们于2011年8月—2012年5月分别在上海市5个规模化猪场和1个屠宰场,采集猪鼻腔拭子样品共计232份。通过7.5%氯化钠肉汤预增菌,显色培养基显色培养分离金黄色葡萄球菌(SA),采用双重PCR方法扩增其中是否含有nuc基因和mecA基因进行MRSA鉴定;以肉汤稀释法进行药物敏感性试验;应用多重PCR方法进行SCCmec基因分型;同时检测杀白细胞素(PVL)基因。结果共计分离得到139株SA,其中70株MRSA,MRSA的检出率为30.2%(70/232)。基因分型显示均为SCCmecⅣb型,未检测到PVL基因,药敏结果显示MRSA除对利奈唑胺,万古霉素,阿米卡星全部敏感外,对头孢噻呋,庆大霉素,诺氟沙星耐药率分别为74.3%,62.9%和42.9%,对阿奇霉素,红霉素,氟苯尼考,氯霉素,苯唑西林的耐药率均为100%,值得注意的,本研究中分离的全部MRSA都对截短侧耳类药物泰妙菌素、沃尼妙林以及人医新药瑞他帕林表现高水平耐药。结论结果显示了上海地区猪源MRSA主要流行SCCmecⅣb型,并且具有多重耐药的特点,尤其对截断侧耳类人医新药全部耐药,这也提示我们要防控动物源耐药菌或耐药基因通过食物链或者环境向人类的传播的潜在风险。

犬表皮细胞生长因子的原核表达和纯化及其活性鉴定

为获得有生物活性的犬表皮生长因子(cEGF),设计了4条引物,用SOE-PCR合成cEGF基因,将cEGF基因克隆至表达载体pET-24a,构建融合表达质粒,转化至E.coli BL21,IPTG诱导表达,对表达得到的重组蛋白进行纯化,MTT法测定重组蛋白的生物活性。结果显示,SOE-PCR合成得到的cEGF基因大小为156bp,编码52个氨基酸。大部分表达为包涵体,通过变性、纯化、复性的过程,每1L菌液得到重组犬rcEGF 16.1mg,经MTT法检测,rcEGF具有生物活性。结果表明,获得了具有生物活性的rcEGF。

不同品种犬表皮生长因子基因的克隆与分子特征分析

为分析和比较不同品种犬的表皮生长因子(canine epidermal growth factor,cEGF)基因的分子特征及其差异,收集11个常见不同品种犬的血样,提取基因组,采用PCR方法分别扩增出编码cEGF的N端和C端结构域的犬32号染色体20和21号外显子,纯化后与pMDTM18-T Vector连接构建重组子并转化大肠杆菌DH5α感受态,PCR鉴定阳性克隆后送样测序,用20和21号外显子序列拼接出cEGF全长,采用BLAST和DNAStar软件分析序列相互关系特征。结果:成功扩增出11种不同品种犬EGF编码基因,全长为156 bp,编码52个氨基酸,犬EGF基因序列同源性在97.4%～100%之间。根据cEGF编码基因推导氨基酸序列同源性为98.1%～100%,除了杜宾犬(Doberman Pinscher)EGF氨基酸在52位点处R→F,其余的氨基酸序列都一致。cEGF氨基酸序列与几种其他动物及人EGF相比较发现:cEGF与家猫EGF(Felis catus EGF)同源性很高,达到94.2%。表明不同品种犬的EGF编码基因有很高的同源性且非常保守,并与家猫EGF也有很高的同源性。

上海市猪源与人源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分离及分子分型

为研究上海地区猪源和人源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的流行及分子分型特点,分别在上海市3个规模化猪场及1个屠宰场采集猪鼻腔拭子共计170份;在上海市某医院采集不同住院病人的痰、咽拭子等样品共计120份。所有样品通过75g/L氯化钠肉汤预增菌,显色培养基显色培养及双重PCR(nuc和mecA基因)方法分离鉴定金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;采用金黄色葡萄球菌盒式染色体、多位点序列和葡萄球菌蛋白A方法进行分型。结果显示,共分离到83株猪源金黄色葡萄球菌,其中45株为猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;52株人源金黄色葡萄球菌,其中15株为人源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。分型结果显示猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌全部为ST9-SCCmecⅣb型,其中37株为spat899型,2株为spat2922型。人源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中14株为ST5-SCCmecⅡ-t002型,1株为ST88型,其用葡萄球菌蛋白A方法分型为新型,已被命名为t10775型,用金黄色葡萄球菌盒式染色体方法未能分型。结果表明,上海地区猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌主要流行的是ST9-t899-SCCmecⅣb型,而人源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌主要流行的是ST5-t002-SCCmecⅡ型,猪源和人源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌之间暂未发现有相互传播的迹象。