萤火虫荧光素酶标记结直肠癌模型的建立

针对小鼠结直肠癌细胞(CT26)构建能够稳定表达萤火虫荧光素酶Firefly luciferase(Fluc)以及具有嘌呤霉素抗性的CT26-Fluc细胞株,并建立其荷瘤鼠模型。采用同源重组技术将Firefly luciferase基因片段整合至转座子系统中得到质粒,将所得质粒转染进入CT26原始细胞株,使其在该细胞内表达。后通过细胞敏感性实验获得CT26最低致死浓度,筛选获得稳定表达荧光素酶的CT26-Fluc单克隆细胞系。流式细胞仪检测CT26-Fluc单克隆的纯度。同时利用显微观察等方法证实细胞增殖和细胞形态与CT26原始细胞系不存在显著差异。将构建成功的CT26-Fluc植入BALB/c小鼠右后侧背部皮下,通过小动物活体成像仪验证该细胞系能稳定表达荧光素酶,且能够用于小鼠结直肠癌成瘤模型。本实验成功构建了稳定表达Firefly luciferase的CT26-Fluc细胞系,为小鼠结直肠癌模型及其病灶转移机制的研究建立了技术基础。

表达近红外荧光蛋白的结肠癌细胞系的建立

通过PiggyBac转座子系统,构建能够稳定表达近红外荧光蛋白iRFP720的CT26鼠结肠癌细胞株,通过嘌呤霉素筛选获得CT26-iRFP720单克隆细胞株。流式细胞仪验证表明所得CT26-iRFP720细胞株纯度为98.1%;Western Blot检测结果表明,iRFP720基因的引入不会改变细胞PD-L1的表达。将构建成功的细胞株植入BALB/c小鼠皮下,成功建立CT26-iRFP720肿瘤模型,且利用动物活体成像可以观察到iRFP720的表达。结果表明稳定,可实时观察的CT26-iRFP720结肠癌BALB/c小鼠模型成功建立。

表达人源PD-L1的4T1细胞系的构建

为构建稳定表达人源hPD-L1分子的小鼠乳腺癌细胞系(4T1),建立BALB/c小鼠乳腺癌肿瘤模型,采用Lipofactamine 3000转染试剂将携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)和hPD-L1的质粒转入4T1细胞中,经嘌呤霉素筛选获得4T1-hPD-L1单克隆细胞系,通过流式细胞术检测细胞纯度。将构建成功的细胞系皮下植入BALB/c小鼠背部,建立乳腺癌皮下肿瘤模型。流式细胞术检测4T1-hPD-L1细胞中GFP、PD-L1双阳性率为97.0%。将4T1-hPD-L1单克隆细胞系皮下接种于BALB/c小鼠背部可成瘤。成功构建稳定表达hPD-L1分子的4T1单克隆细胞系,并建立BALB/c小鼠乳腺癌肿瘤模型,为进一步研究PD-L1抗体药物提供参考。