杭州市2013～2014年流感暴发流行期甲型流感病毒H3N2亚型基因特性分析

目的分析杭州2013~2014年冬春季流感暴发期间流行的甲型流感病毒H3N2亚型的分子特性。方法选取H3N2阳性标本提取病毒RNA,PCR扩增全基因组并测序,构建血凝素（HA）及神经氨酸酶（NA）分子进化树,对H3N2亚型的病毒进化进行分析。结果 6个代表株中H3N2未发生片段间的重配。以WHO推荐流感疫苗株A/TEXAS/50/2012为参考,HA1蛋白主要抗原决定区发生N145S氨基酸替换,并有其他多个位点的突变。病毒基质蛋白（M2）的金刚烷胺耐药位点全为S31N,神经氨酸酶抑制剂耐药位点未发生突变。结论 H3N2亚型甲型流感病毒HA1蛋白的氨基酸变异与2013~2014年杭州地区暴发流行有关。另外,病毒已出现对金刚烷胺的耐药突变,而对神经氨酸酶未发生耐药突变。

实时荧光定量PCR检测人IL-9 mRNA方法的建立及应用

目的：建立检测人白介素-9（interleukin-9，IL-9）mRNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR（real—time fluorescence quantitative PCR，qRT—PCR）方法。方法：分离人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear ceils，PB—MC），经PMA和离子霉素刺激活化后提取总RNA并逆转录成cDNA。扩增产物与pMD-18T载体连接构建质粒标准品。采用qRT—PCR方法检测IL-9mRNA的表达水平。评价该方法的线性及特异性，应用该方法检测Graves病患者PBMC中IL-9 mRNA表达水平。结果：建立了人IL-9的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该法的标准曲线相关系数r^2为0．995～0．998，熔解随线分析产物为单峰。Graves病患者PBMC中IL-9 mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组（P〈0．01）。结论：建立的检测人IL-9 mRNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法灵敏、特异性好，为进一步临床应用提供了实验基础。

2013～2014年杭州地区手足口病柯萨奇病毒A6型和A10型VP1基因特征分析

目的了解2013-2014年杭州地区手足口病病原谱的分布,并对其病原基因特征进行分析。方法采集2013年3月至2014年4月手足口病患儿标本1 340例,提取病毒核酸,通过逆转录和PCR扩增肠道病毒VP1序列并测序,经Blast比对确定病毒基因型。对柯萨奇病毒A6型（CA-A6）和A10型（CA-A10）VP1全长序列进行同源性比对分析,并构建系统进化树。结果1 340例手足口病患儿标本中,肠道病毒检出阳性率为81.43%（1 090/1 340）。其中,CV-A6阳性率为41.04%,取代EV-71（14.48%）成为杭州地区检出阳性率最高的肠道病毒;CV-A10检出率（8.51%）也高于CV-A16（3.81%）,列于第三位。同源性比对及系统进化分析显示,2013-2014年的25株CV-A6病毒核苷酸同源性为89.0%-99.7%,主要分布于G、H基因亚型;15株CV-A10病毒核苷酸同源性为95.3%-99.9%,分布于F、G基因亚型。结论 2013-2014年杭州地区儿童手足口病的主要病原体发生重大变化,CV-A6病毒成为最主要病原,CV-A10病毒也存在潜在威胁,需加强对其他肠道病毒的持续监测和分子特征分析。

五重荧光定量RT-PCR法检测甲型流感病毒

目的建立一种五重荧光定量RT-PCR检测并鉴别流感病毒A(Flu A)及血凝素H3、H5、H7基因亚型的方法。方法以人细胞核糖核酸酶P(RNase P)基因为内参照,用Primer Express 3.0软件设计PCR特异性引物和探针。构建质粒标准品用于分析该方法的灵敏度和重复性,利用不同来源的呼吸道病毒样本进行特异性分析。结果该法检测Flu A、H3、H5、H7以及RNase P质粒标准品的灵敏度均达102copies/m L,特异性达100%,各对引物和探针仅检测出相应的病毒,未有交叉反应,变异系数(CV)≤1.99%。结论建立的五重荧光定量RT-PCR法灵敏度、特异性高,重复性好,可用于检测出多种甲型流感亚型,对甲型流感病毒不同亚型早期诊断具有一定的价值。

2013-2015年浙江地区新型甲型H1N1流行性感冒的流行病学和临床特征调查

目的调查2013-2015年浙江地区哨点医院监测的新型甲型H1N1流行性感冒(简称流感)的临床特征及其流行病学特征。方法对2013-2015年浙江地区8家哨点医院纳入的符合急性呼吸道感染的患者进行流行病学和临床特征调查,采集研究对象呼吸道标本进行流感病毒检测,分析新型甲型H1N1流感病毒阳性组与阴性组的临床和流行病学特征。结果 8家哨点医院共纳入7 602例急性呼吸道感染患者,其中,实验室确诊新型甲型H1N1流感779例(10.2%),新型甲型H1N1流感患者中位年龄为51岁,115例(33.6%)患有至少1种慢性基础性疾病,新型甲型H1N1流感中哮喘比例(2.6%)高于流感病毒阴性患者(0.6%),差异有统计学意义(χ2=12.706,P<0.01)。新型甲型H1N1流感中恶心、呕吐所占比例高于流感病毒阴性患者,排痰性咳嗽、腹泻所占比例低于流感病毒阴性患者。新型甲型H1N1流感患者的白细胞计数和中性粒细胞计数均低于流感病毒阴性组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论浙江地区人感染新型甲型H1N1流感的高发期为每年的冬春季节,其他时间呈散发。新型甲型H1N1流感的临床症状与非流感患者相比较无特异表现。

人感染高致病性H5N6禽流感病毒的分子生物学特征

目的分析2014-2015年3例新型人感染高致病性禽流感（HPAI）H5N6毒株的血凝素（HA）与神经氨酸酶（NA）基因序列,探讨该病毒的遗传变异及分子生物学特征。方法收集Gen Bank、全球共享禽流感数据倡议组织（GISAID）及浙江大学传染病诊治国家重点实验室提供的H5N6病毒基因序列,利用生物信息软件MEGA6.0及Net Nglyc服务器对基因序列进行遗传进化和分子变异特征分析。结果 3例感染HPAI-H5N6患者毒株的HA与NA氨基酸序列的同源性分别为96.5%～98.7%和90.1%～98.2%;HA氨基酸序列比对分析发现A/Guangzhou/39715/2014（H5N6）和A/Sichuan/26221/2014（H5N6）与A/duck/Eastern China/1111/2011（H5N2）同源性最近,分别为97.7%和98.5%;A/Yunnan/0127/2015（H5N6）与A/muscovy duck/Vietnam/LBM631/2014（H5N1）同源性最近（97.2%）;NA氨基酸序列比对分析发现A/Guangzhou/39715/2014（H5N6）和A/Yunnan/0127/2015（H5N6）与A/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）同源性最近,分别为97.2%和97.6%,A/Sichuan/26221/2014（H5N6）与A/duck/Guangdong/S3073/2010（H6N6）同源性最近（97.4%）;进化树分析显示3例患者毒株处于2个不同的分支;HA基因包含有S137A、T160A等突变,糖基化分析显示有6～7个N-糖基化位点。结论新型人感染HPAI-H5N6病毒是一种重组病毒,其HA基因来源于亚洲禽类H5亚型,NA基因来源于亚洲禽类H6N6;HA基因位点突变及N-糖基化改变可能有助于增强对人类的感染。

四重荧光定量RT-PCR检测人感染新型甲型禽流感H7N9病毒

目的建立检测人感染新型甲型禽流感H7N9病毒的四重荧光定量RT-PCR方法。方法以人细胞RNA酶P(RNase P)基因为内参,用Primer Express3.0软件设计PCR特异性引物和探针。通过不同来源的呼吸道病毒进行特异性分析,构建质粒标准品用于分析该方法的灵敏度和重复性,并对1 896例临床标本进行回顾性检测。结果该方法检测甲型流感病毒(Flu A)、H7、N9与RNase P灵敏度均达102copies/m L,特异性达100%,每对引物和探针只检测出相应的病毒,无交叉反应,检测变异系数(CV)均低于1.55%。用该法检测1 896例临床标本,结果 Flu A 235例,H7N9 127例,与其他试剂报告结果完全一致。结论建立的四重荧光定量RT-PCR法可快速检测H7N9病毒,灵敏度与特异性好,可用于H7N9病毒感染患者的早期诊断。

IL-9在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平

目的:检测变应性鼻炎患者IL-9的表达水平,探讨IL-9在变应性鼻炎发生发展中的意义。方法:收集49例变应性鼻炎患者的外周血标本,其中未治疗组30例,临床缓解组19例,另取30例健康志愿者的外周血标本作为正常对照组。采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测IL-9基因在外周血中的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆IL-9含量。结果:变应性鼻炎未治疗组外周血单个核细胞中IL-9 mRNA表达水平及血浆IL-9含量明显高于变应性鼻炎临床缓解组和正常对照组(P<0.05),而变应性鼻炎临床缓解组与正常对照组比较差异无统计学意义。变应性鼻炎未治疗组IL-9 mRNA表达水平与临床评分呈正相关。结论:变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中IL-9呈高表达。IL-9可能参与了变应性鼻炎的病理过程,具体机制有待进一步探讨。

2009～2012年杭州地区甲型H1N1流感病毒HA与NA基因的进化分析

目的研究杭州地区2009年至2012年甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)的基因进化特征,分析该病毒的遗传变异和抗原的分子水平转变。方法用RT-PCR分别扩增甲型H1N1流感病毒HA基因和NA基因片段并进行测序,用DNAMAN和MEGA 4.0生物信息学软件对HA和NA基因序列进行进化分析。结果建立的RT-PCR可成功检测HA(C)、HA(D)和NA基因,遗传进化分析结果表明,杭州地区甲型H1N1流感病毒的HA与NA氨基酸序列的亲缘系数与WHO推荐的病毒株及国内代表株的同源性均为98.9%～100%;三维构象结果表明,HA编码的蛋白质有5个位点发生改变,而NA编码的蛋白质仅发生2个位点改变。结论 2009年至2011年杭州地区甲型H1N1流感病毒HA和NA基因序列与世界范围内流行的病毒参考株具有高度同源性,但HA与NA蛋白质表位存在某些氨基酸位点的改变。

浙江地区2012年麻疹病毒流行株基因特征研究

目的探讨浙江地区2012年3～9月麻疹病毒(MV)的基因特征。方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测麻疹患者的咽拭子标本,对部分PCR扩增阳性的片段进行基因测序并绘制系统进化树进行同源性分析。结果 88例麻疹患者咽拭子标本中经RT-PCR检测阳性76例,阴性12例;随机选择13例阳性标本进行基因测序,结果显示均为H1a亚型;系统进化树分析结果表明,13株均为H1a基因亚型,与该型参考株AF045205、AF045206核苷酸同源性为98.0%～99.0%。结论 H1a基因型是浙江地区2012年MV流行的优势亚型,无输入性的其他亚型出现。

双重荧光定量RT-PCR法检测柯萨奇病毒A2和A5型

目的建立同时检测柯萨奇病毒A2和A5型(CVA2、CVA5)的双重实时荧光定量RT-PCR法。方法用Primer Express3.0软件设计高度特异性引物和荧光标记探针。通过优化反应体系,建立标准曲线,并评价双重荧光定量RT-PCR法的特异性、灵敏度和重复性。用建立的方法检测367例疑似手足口病患儿的粪便标本,并对阳性结果测序验证。结果荧光定量RT-PCR结果表明本实验所选的引物和探针可特异性检测并区分出CVA2、CVA5亚型,与其他肠道病毒的阳性核酸未发生交叉反应。该方法最低检测限达到102copies/m L,批内变异系数(CV)均<1.49%。367份临床标本中CVA2型阳性23份,阳性率6.3%;CVA5阳性11份,阳性率3%,检测阳性结果与测序结果一致。结论成功建立了在单管中同时检测并鉴别CVA2、CVA5型的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有较好的灵敏度、特异性、重复性,可用于CVA2、CVA5型引起的暴发疫情的快速筛查和手足口病的流行病学的研究。

2011～2013年杭州市手足口病病原谱流行特征及柯萨奇病毒A16型VP1区基因变异研究

目的了解杭州市手足口病病原谱流行特征及柯萨奇病毒A16型（CA16）分离株的VP1基因变迁规律。方法采集杭州市2011-2013年手足口病患者的2 197份临床标本,用通用引物进行肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测,对阳性标本进行分型,对部分CA16感染阳性重症患者标本测定VP1基因序列并进行同源性比对和系统进化树分析。结果杭州地区肠道病毒通用型核酸检出率为56.0%（1 317/2 197）,肠道病毒71（EV71）、CA16和其他肠道病毒的检出率分别为24.1%（530/2 197）、13.9%（306/2 197）和22.8%（501/2 197）。在咽拭子和粪便标本中EV71检出率均最高,分别为23.9%（301/1 258）和23.6%（148/627）,而在疱疹液标本中其他型肠道病毒检出率最高,为32.6%（76/233）,脑脊液标本中无CA16检出。咽拭子标本和粪便标本在发病初期的检出率较高,发病后第5天和第6天后检出率低于发病初期检出率,而脑脊液和疱疹液不同病程阶段的检出率无统计学意义。9株CA16分离株VP1基因的核苷酸同源性为90.8%-99.7%,分属于B1b亚型和B1a亚型。结论 2011-2013年杭州地区手足口病患者主要病原体以EV71和CA16为主,样本类型和采样时间是影响肠道病毒检出率的重要原因。杭州地区CA16毒株VP1区基因的变异程度较低,需进一步加强开展手足口病的监测。

胶原诱导性关节炎小鼠Th17细胞的检测及意义

目的:研究Th17细胞及其相关细胞因子白细胞介素-17(IL-17)在胶原诱导性关节炎(collagen-induced ar-thritis,CIA)小鼠体内的变化。方法:利用Ⅱ型胶原蛋白建立小鼠CIA模型。应用流式细胞术(FCM)分析小鼠脾脏及引流淋巴结中Th17细胞的比例,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中IL-17的含量。结果:CIA小鼠脾脏及引流淋巴结中Th17细胞的比例分别为(3.19±0.70)%、(3.54±0.97)%,显著高于正常对照组的(0.95±0.34)%、(1.31±0.47)%,P<0.01。CIA小鼠血清中IL-17的含量也明显高于正常对照组(P<0.05)。结论:Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17在CIA小鼠体内明显升高,并与疾病的发生密切相关。

Graves病患者外周血单个核细胞GITR mRNA表达水平的变化和意义

目的探讨Graves病(GD)患者糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)mRNA表达水平的变化及意义。方法用实时荧光定量PCR法检测22例GD未治疗组、23例GD临床缓解组及18例健康对照组外周血单个核细胞(PBMC)GITR mR-NA相对表达水平;用化学发光法测定各组血浆中甲状腺激素水平,并评价GD未治疗组GITR mRNA相对表达水平与甲状腺激素水平的相关性。结果GD未治疗组GITR mRNA相对表达水平明显低于临床缓解组和健康对照组(χ2=18.48,P<0.01;χ2=18.26,P<0.01),而GD临床缓解组与健康对照组差异无统计学意义(χ2=0.12,P>0.05)。GD未治疗组GITRmRNA相对表达水平与FT3、FT4水平均呈负相关(r=-0.509、r=-0.483,P均<0.05),而与TSH呈正相关(r=0.458,P<0.05)。结论GD的发生可能与GD患者体内GITR基因表达下调有关。

小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:体外原核表达小鼠Foxp3蛋白,并以其免疫家兔,制备多克隆抗体。方法:从质粒Foxp3-pMD-18T扩增小鼠Foxp3全长基因,亚克隆至原核表达载体pET-32 a,转化E.coliBL-21;IPTG诱导表达目的蛋白,N i2+-NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白;纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹检测抗体特异性。结果:成功构建了Foxp3-pET-32 a原核表达载体,表达和纯化了目的蛋白;ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论:成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。

人RORγtm RNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立检测人RORγt(retinoid-related orphan receptor gammat)mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)方法。方法:根据人RORγt mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经PMA和离子霉素刺激的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)总RNA,并逆转录成cDNA,与pMD-18T载体连接构建质粒标准品。采用qRT-PCR方法检测RORγt mRNA水平,并评价该方法的线性、特异性及重复性。应用该方法检测Graves病(Graves′disease,GD)患者外周血中RORγt mRNA的相对表达。结果:该方法标准曲线的相关系数为0.998,融解曲线分析显示单个峰,pMD18T-RORγt质粒标准品高、低拷贝数的批内、批间变异系数分别为6.5%,8.4%和9.6%,11.2%。初步研究表明GD患者组RORγt mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组(t=-3.72,P<0.01)。结论:建立的检测人RORγt mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法灵敏、特异且重复性好,为临床应用提供了实验基础。

结直肠癌组织中GITRL mRNA表达水平的检测及其临床意义

目的:建立检测人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(human glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor ligand,hGITRL)mRNA的实时荧光PCR方法,探讨hGITRL表达与结直肠癌发生发展的关系。方法:构建含hGITRL基因片段的标准质粒,通过实时荧光PCR检测20例结直肠癌组织与对应癌旁组织中GITRLmRNA的表达水平。结果:建立的hGITRLRT-PCR基因定量检测方法准确可靠(标准曲线相关系数为0.99983);在20例结直肠癌组织细胞中,GITRL表达水平较之对应的癌旁组织有所升高(P<0.05),且与肿瘤组织分型和临床分期存在相关性。结论:成功建立了检测hGITRLmRNA的实时荧光定量PCR方法,GITRL在结直肠癌组织细胞中表达量升高,且与癌症的严重程度呈现一定的相关性。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠GITRL蛋白并鉴定

目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的配体(G ITRL)蛋白。方法:用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切GITRL-PMD18T载体,回收目的基因G ITRL,并定向克隆入穿梭质粒pFastBacHTA中。以pFastBacHTA-G ITRL转化感受态DH10Bac细菌,在DH10Bac细菌内重组pFastBacHTA与杆粒发生转座。筛选阳性克隆,提取重组杆粒,转染Tn昆虫细胞株,获取完整的重组杆状病毒。反复感染Tn细胞,扩增病毒同时表达目的蛋白,用Western blot法进行蛋白鉴定。结果:经核苷酸序列测定及PCR鉴定,成功地获得含GITRL基因的重组杆粒。在杆粒转染的Tn细胞中表现有细胞病变,推断转染成功并获得重组杆状病毒。Western blot法鉴定显示,在Mr20000处有特异性的蛋白条带。结论:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功地表达了小鼠GITRL蛋白,为进一步研究其生物学活性及功能奠定了实验基础。

四重荧光定量rRT-PCR法检测柯萨奇病毒B1、B2、B3及其他未分型肠道病毒

目的建立检测柯萨奇病毒(CoxB1、CoxB2、CoxB3)和其他未分型肠道病毒(EV)的四重荧光定量rRT-PCR法。方法用Primer Express 3.0软件设计特异性引物和探针,优化反应体系,评价建立的rRT-PCR法的灵敏度、特异性和重复性,并用该法检测535份病毒性心肌炎患儿粪便标本和43份咽拭子标本,对阳性结果测序验证。结果 rRT-PCR法检测CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他未分型EV灵敏度均达103copies/mL,特异性较高,检测CV均<1.0%。578份临床标本用该法检测EV为153份,其中CoxB1病毒69份,CoxB2病毒18份,CoxB3病毒27份,其他未分型EV 39份。随机选取CoxB1、CoxB2、CoxB3病毒检测阳性样本各10例测序,均与该法的检测结果一致。结论建立的四重荧光定量rRT-PCR法可同时检测并区分CoxB1、CoxB2、CoxB3病毒和其他未分型EV,可用于此类病毒引起的暴发疫情的实验室应急诊断。

浙江省急性腹泻患儿中肠道病毒检测分析研究

目的探讨浙江省急性腹泻患儿的常见病毒组成。方法采集5岁以下(≤5岁)急性腹泻患儿的811份粪便标本,采用ELISA方法检测A组轮状病毒(RV),应用多重PCR方法同时检测B/C组RV、诺如病毒(NoV)、札如病毒(SaV)、肠道腺病毒(AdV)、星状病毒(AstV),并利用RT-PCR对RV的阳性标本进行G、P分型。结果811份粪便样本中,RV、NoV、SaV、AdV及AstV总的阳性比例分别为25.52%、18.37%、4.44%、2.71%和1.23%;65份(8.01%)混合感染标本中以RV和NoV混合感染所占比例最大(56.92%);116份RV的G/P分型中,G3型(37.93%)、G1型(32.75%)和P[8]型(57.76%)是RV的优势型别,且G3/P[8](27.59%)是混合感染最主要的组合。结论浙江省五种常见腹泻病毒及其混合感染的流行状况,为临床治疗和疾病监测提供参考价值。