伴刀豆球蛋白A诱导肝细胞损伤的磷酸化蛋白质组学研究

目的·研究伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,ConA)诱导肝细胞损伤过程中全细胞蛋白质的磷酸化修饰水平的变化规律。方法·将小鼠肝细胞株AML12与ConA(10μg/mL)共培养,诱导肝细胞损伤模型,12 h后提取细胞的总蛋白,经消化酶解后富集肽段,并使用高效液相-质谱联用分析仪进行检测。采用非标定量法对磷酸化位点和肽段进行鉴定与相对定量分析。筛选出单位点磷酸化修饰水平差异达到2倍以上的蛋白进行生物学功能富集分析和蛋白互作调控网络分析。结果·在ConA诱导的AML12细胞损伤模型中,共鉴定到磷酸化修饰肽段11200条,可定位定量的肽段2685条。其中差异性调控的磷酸化修饰肽段82条,对应77个蛋白。这77个磷酸化蛋白主要与蛋白质结合、酶活动等相关,且主要通路与细胞凋亡以及RAS激酶通路相关。结论·AML12细胞在ConA诱导的肝细胞损伤过程中发生了磷酸化修饰变化,差异磷酸化修饰的蛋白可能与肝细胞凋亡相关。

重组人白介素1受体拮抗剂对肝细胞的保护作用

目的·利用HepG2细胞建立D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-Gal N)体外肝细胞损伤模型,研究重组人白介素1受体拮抗剂(recombinant human IL-1Ra,rh IL-1Ra)对肝细胞的保护作用。方法·建立D-Gal N诱导HepG2细胞损伤模型,将HepG2细胞放置于含有不同浓度的D-Gal N培养基中(0.02、0.2、2、4 mg/m L),在第1、2和3日分别观察细胞形态和活力变化,优化D-Gal N浓度和处理时间;研究不同IL-1Ra浓度(10、20、50μg/m L)处理的D-Gal N损伤模型细胞形态变化,测定细胞活力;分析各组细胞凋亡情况和各组胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平,运用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测各组细胞中凋亡诱导相关细胞因子白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6 (interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的m RNA水平,并采用ERK1/2通路抑制剂(SCH772984)检测IL-1Ra是否是通过促进肝损伤细胞ERK1/2磷酸化的方式来保护肝细胞。结果·采用4 mg/m L浓度的D-Gal N处理HepG2细胞2 d后,细胞活力显著下降;rh IL-1Ra显著提高损伤模型细胞的存活率,减少细胞中ROS的生成,显著抑制D-Gal N诱导的细胞内凋亡诱导相关细胞因子的表达;ERK1/2信号途径在介导IL-1Ra保护肝细胞的损伤过程中有一定的作用。结论·rh IL-1Ra可直接靶向肝细胞,并通过在细胞内上调ERK1/2信号通路的活化水平,抑制细胞凋亡,发挥对肝损伤细胞的保护作用。

重组人骨桥蛋白在哺乳动物细胞中的表达、纯化和活性研究

旨在运用哺乳动物表达载体的瞬时转染技术,转染人类胚胎肾细胞(Human Embryonic Kidney 293E,HEK293E),分泌性表达和纯化带His标签的重组人骨桥蛋白(Recombinant Human Osteopontin,rhOPN),并研究其促结肠癌以及非小细胞肺癌细胞增殖功能。合成和构建OPN融合6×His标签重组蛋白的表达载体pcDNA3.1-OPN,利用聚醚酰亚胺(Polyetherimide,PEI)瞬时转染法将pcDNA3.1-OPN转染到HEK293E细胞中,并用镍亲和层析柱对rhOPN进行纯化。SDS-PAGE电泳和Western Blot被用来检测纯化后的rhOPN蛋白在凝胶上的迁移率和纯度。此外,ELISA方法被用于测定rhOPN与抗OPN抗体间的结合能力,并用CCK-8(Cell Counting Kit-8)方法初步研究rhOPN蛋白对结肠癌及非小细胞肺癌细胞增殖的影响。结果显示,通过将pcDNA3.1-OPN瞬时转染HEK293E细胞,成功表达和纯化出纯度达95%的rhOPN,且rhOPN可以被抗OPN抗体很好的识别。rhOPN被证实在36μg/ml浓度时即可显著促进体外培养的HT29细胞增殖,在20μg/mL时能够促进体外培养的非小细胞肺癌H1299及HCC827细胞增殖。运用哺乳动物细胞瞬时转染技术,在HEK293E细胞中成功表达并纯化出高纯度的rhOPN蛋白,并发现rhOPN可以显著促进结肠癌及非小细胞肺癌细胞增殖,具有良好的生物学活性。